发酵现象实验报告

　　一、实验目的

　　（1）掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法

　　（2）了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项

　　（3）熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择

　　二、实验仪器及试剂

　　菌种：黑曲霉

　　仪器：锥形瓶（500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、纱布（8层）、pH计。

　　药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮

　　三、实验原理

　　摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培养基的摇瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。

　　葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）系统名为淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原末端切开α-1,4键，也能切开α-1,3键和α-1,6键，产生葡萄糖。

　　糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

　　四、实验步骤

　　1.培养步骤

　　1.1种子培养基制备及灭菌

　　将新鲜土豆去皮切块，称取200~300 g土豆块放入500 mL烧杯中，加入一定量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用120目纱布过滤，滤渣反复用一定量水清洗、过滤2次，合并各次滤液且定容至1000 mL即得土豆汁。取一定体积的土豆汁，在其中加入5%的蔗糖，溶解摇匀并调pH至5.5，即得种子培养基。将适量种子培养基倒入锥形瓶（250ml），用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。待灭菌完毕，冷却取出。

　　1.2发酵培养基制备及灭菌

　　取6只500mL摇瓶，分别按装液量100、200、300mL配制培养基（玉米粉6%、豆饼粉2%、麸皮1%），加水后稍微摇动，使原料湿润，浸入水中。用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。

　　1.3发酵培养基接种：将已生长好的菌种，在无菌条件下，按照10%的接量（8%-12%）接种到发酵培养基上。

　　1.4发酵培养基发酵：将摇瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为120r/min，培养时间96h。显微镜观察菌丝形态，用试纸测发酵液pH，测定酶活力。摇瓶培养时观察各种摇瓶机的结构。

　　2.糖化酶活力测定

　　2.1待测酶液的制备：

　　精确吸取液体酶1.00mL，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100~250u/mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

　　2.2酶活力测定：

　　于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2mL，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液与空白液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10mL，再加氢氧化钠溶液15mL，摇匀塞紧，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2mL，立即用硫代硫酸钠标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

　　2.3酶活力计算：

　　样品酶活力（u/g或u/mL）=579.9×(A-B)c×n式中：A与B分别为空白、样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；n为稀释倍数。

　　五、数据分析

　　比较不同装液量下的菌体形态特征、酶活力，将结果填入下表：

　　装液量/mL

　　指标

　　酶活力

　　pH

　　菌体特征 100 420u/mL 4.2 200 510u/mL 4.1 300 570u/mL 3.8 出现球状的白色的菌丝团，瓶壁上出现黑丝的孢子和菌丝

　　六、结论

　　1.不同的装液量对酶活力的影响是随着装液量的增加呈现上升的趋势，但是酶活力变化不大，并且酶活力不高，与其他组数据相比接种量跟酶活力关

　　2.菌体特征在锥形瓶的瓶壁上出现白色的菌丝，在培养基中也出现了丝球

　　3.菌种新陈代谢的旺盛二氧化碳的释放增加，使pH值逐渐下降，最终使培养基的pH下降至3.8左右。