食品和水中肠球菌检验方法

疾病预防控制中心 作业指导书 肠球菌测定 文件代码 SQCDC/ZYZ017-2009 第一版 第0次修订 第1页 共12页 实施日期 2009年3月15日 肠球菌检验方法

一、目的

规定了食品和水中肠球菌平板计数、最近似值测定的检验方法。 二、适用范围

本部分适用于生活用水、生产加工用水及食品中肠球菌的检验。 规范性引用文件

下列文件中的条款通过SN / T 1933 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB / T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 SN / T 0330 出口食品中微生物学检验通则

三、术语、定义和缩略语 3 .1术语和定义

下列术语、定义和缩略语适用于SN / T 1933 的本部分。肠球菌Enterococci

一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽胞和荚膜，可分解胆汁七叶苷。是评估食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状况的指标菌之一。 3 . 2 略缩语 3 . 2 . 1 BEA 胆汁七叶苷琼脂。 3 . 2 . 2 BHIB 脑心浸液肉汤。 3 . 2 . 3 BHIA 脑心浸液琼脂。

四、设备和材料

4.1电子天平：感量为0．001g 。 4.2恒温水浴箱：46 ℃ 士1 ℃ 。

4.3恒温培养箱：35℃士0.5℃，36℃士1℃，45℃ 士0.5℃，35℃士2℃ 。 4.4均质器。 4.5振荡器。

4.6移液管：容量1mL,10mL。 4.7培养皿。 五、培养基和试剂

实验用水符合GB / T 6682 分析实验室用水规格和实验方法的要求。除另有规定外，试剂为分析纯。

5 . 1叠氮化钠葡萄糖肉汤（见附录第A.l章）。 5 . 2 肠球菌肉汤（见附录第A . 2 章）。 5 . 3 KF 链球菌琼脂（见附录第A . 3 章）。

5 . 4 肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）（见附录第A . 4 章） 5 . 5 胆汁七叶苷琼脂（BEA 琼脂）（见附录第A . 5 章） 5 . 6 脑心浸液肉汤（见附录第A . 6 章）。

5 . 7 含6 . 5 ％氯化钠（NaCl）脑心浸液肉汤（见附录第A . 7 章）。 5 . 8 脑心浸液琼脂（见附录第A . 8 章）。 5 . 9 缓冲蛋白胨水（见附录第A．9 章）。 六、样品制备

6 . 1抽样数量及抽样方法

抽样数量及抽样方法按SN / T 0330 进行。 6 . 2 样品的贮存和运送

采样后应尽快进行检验，冷冻样品如不能立即进行检验，应置于-18 ℃ 保存。应冷藏保存

的待检样品在运送实验室过程中应于1 ℃ ~ -4 ℃ 保存。样品采集后8h 之内要完成检验。

6 . 3制样

6 . 3 .1水及液体饮料：污染程度低的水及液体饮料可以直接进行检验；污染程度严重的水

及液体饮料吸取25 mL 样品，加人225 mL 缓冲蛋白胨水中，充分混匀，制成1：10 样品匀液。

6 . 3 . 2 固体或半固体食品：无菌操作取25g样品放人装有225 mL 缓冲蛋白胨水的均质杯

内，以8000r/min均质1min~2 min ，制成1 : 10 样品匀液。

6 . 3 . 3 以上样品制备可根据样品污染程度及检验需要，进一步制成功倍递增的样品稀释

液。

食品和水中肠球菌平板计数法检验程序见图1 。

25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水

↓ 10 倍梯度稀释

↓

选择2 个~3 个适宜连续稀释度，各取1 mL 分别加入灭菌培养皿

↙ ↘

KF琼脂36℃ 士1℃ 48h 士2h 肠球菌琼脂35℃士2℃ 24h士2h

↘ ↙ 确证实验

↓ 肠球菌阳性

↓

菌落计数及计算

↓ 报告结果

食品和水中肠球菌最近似值（MPN ）测定法检验程序见图2 。

25g（mL ) + 225 mL 缓冲蛋白胨水

↓ 10 倍梯度稀释

↓

选择3 个适宜连续稀释度，各取1 ml 分别加入肉汤中

↙ ↘

叠氮化钠葡萄糖肉汤管 肠球菌肉汤管 37℃ 士1℃ , 24h~48h 35C 士2 ℃ 24h 士2h

↓ ↓ ↓ ↓

无混浊 混浊 变黑 不变黑 ↓ ↓ ↓ ↓

肠球菌阴性 确证实验 确证实验 肠球菌阴性

↓ ↓

肠球菌阳性 肠球菌阳性

↘ ↙ MPN 值法报告肠球菌数／g(mI)

图2 食品和水中肠球菌最近似值（MPN）法的检验程序示意图

八、 检验步骤与计数 8 .1平板计数法 8 .1．1 适用范围

此方法适用于检验未经加工处理的生鲜食品及肠球菌菌数大于10 CFU / g ( mL ）的水和食品。

8 . 1 . 2 培养基制备

制备KF 琼脂培养基或肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）（参见第A . 3 章或第A . 4 章），倾注平板前将融化的培养基于46 ℃ 士1℃ 水浴保温。 8 .1．3 接种和培养

8 . 1 . 3 . 1 根据样品污染情况，选择2 个~ 3 个适宜连续稀释度的样液，分别吸取1mL 稀释液，加人培养皿中，每个稀释度做两个平板。

8 .1．3 . 2 稀释液加人培养皿后，把保持46℃士l℃的KF琼脂或肠球菌琼脂15ml倾人培养皿内，使样液与培养基充分混合。水平放置，使琼脂凝固。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个培养皿所用时间不应超过20min。倒置平板进行培养，KF平板置36℃士l℃培养铭48h 士2h；肠球菌琼脂平板置35 ℃士2℃培养24h士2h 。 8 .1．4 菌落形态观察

肠球菌属细菌在KF 平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐；在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。用灭菌接种针从每个KF 平板或肠球菌琼脂平板挑取10个典型菌落，进一步做确证实验。

8 .1．5 确证实验

典型菌落分别接种到BHIB 肉汤和BHIA 斜面，BHIB 肉汤置35℃士0．5℃ 培养24h 士2h , BHIA 斜面置35℃士0 . 5℃ 培养48h士2h 。

8 .1．5 . 1 BHIB 肉汤培养24h 后，每管肉汤培养物分别接种到相应BEA 平板、BHIB 肉汤及含6 . 5 %氯化钠（NaCI）的BHIB 肉汤中。BEA 平板及含6 . 5 ％氯化钠（NaCI）的BHIB 肉汤置35℃士0 . 5℃ 培养48h 士2h ; BHIB 肉汤置45 ℃ 士0 . 5 ℃ 培养48h 士2h ，观察细菌生长情况。

8 .1．5 . 2 BHIA 斜面培养48h 后，从斜面上挑取菌落作革兰氏染色。

8 . 1 . 5 . 3 革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌；在BEA 平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀）; BHIB 肉汤中45 ℃ 士0．5 ℃ 生长；并且在含6 . 5 ％氯化钠（NaCI）的BHIB 肉汤中35℃士0 . 5℃生长良好；具有以上特性的典型菌落可确证为肠球菌。

8 .1．6 菌落计数

对确证为肠球菌的菌落进行平板计数，生长有30 个~300 个肠球菌为计数合适范围。

8.1．7 结果计算

8 . 1 . 7 . 1 用所选择计数的每个平板上典型肠球菌的菌落数，乘以确认为肠球菌的菌落所占比例，以此求出所选取的同一稀释度两个计数平板的肠球菌菌落数。

示例：10-1稀释样液的两个平板上分别有85 个和90 个菌落，每个平板所挑取的功个典型菌落中，确认为肠球菌的分别有8 个和9 个，则此稀释度的两个计数平板上肠球菌菌落数分别是85 x（8 / 10 ）=68 及90x（9 / 10 ）=81 。

8 .1．7 . 2 若只有一个稀释度平板上的肠球菌菌落数在计数合适范围30 个~300 个之间，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值除以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。 8.1．7 . 3 若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时，按式(1)计算： N=∑C/[(n1+0.1n2)d]………………………………………………… （l) 式中：

N ― 样品中肠球菌菌落数；

∑C ― 两个连续稀释度平板（含适宜范围菌落数的平板）肠球菌菌落数之和 n1 ― 适宜范围菌落数的第一稀释度（低）平板个数； n2 ― 适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数； d ― 第一稀释度的稀释倍数。 示例： 稀释度 菌落数 1:10（第一稀释度） 245,247 1:100（第二稀释度） 31,30 N=∑C/[(n1+0.1n2)d] =( 245 + 247 + 31 + 30 )/[(2 + 0.1x2）x10-1]=2514 上述数据经修约后，结果表述为2 .5x103 CFU/g(mL）。

8 . 1 . 7 . 4 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无特征性菌落生长，则以小于l/d(d一最低稀释倍数）计算。

8 . 1 . 7 . 5 低数值的估算：如果实验样品原液（水及液体饮料）或初始稀释悬液（其他食品）的两个琼脂平板上的菌落数均小于30 个，计算两个琼脂平板上菌落数的算术平均数。计算方法见式（2 ) :

NE=∑C /nd…………………………………( 2 ) 式中：

NE ― 每毫升或每克样品中肠球菌数的估算值； ∑C ― 两个琼脂平板上肠球菌菌落数的和；

n― 琼脂平板的数量；

d ― 样品初始悬液或实际接种悬液的稀释倍数。

8 . 1 . 7 . 6 大数值的估算：若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 ，计数最接近300 个菌落数的琼脂平板上的菌落并计算出算术平均数。其他平板可记录为多不可计。 结果计算见式（3 ) :

NF=∑C /nd……………………………………………… （3 ) 式中：

NF ― 每毫升或每克样品中肠球菌菌落数的估计值； ∑C ― 两个琼脂平板上肠球菌菌落数之和； n― 琼脂平板的数量；

d ― 与样品悬液相一致的稀释倍数。 8 . 1 . 8 结果表述方式

8 .1．8 . 1 菌落数在100 以内时，按有效数字修约规则修约，采用两位有效数字报告。 8 .1．8 . 2 菌落数大于或等于100 时，前第3 位数字采用有效数字修约规则修约后，取前2 位数字，后面用。代替位数来表示结果；也可用10 的指数形式来表示，此时也按有效数字修约规则修约，采用两位有效数字。 8 . 1 . 9 结果报告

固体样品以CFU/g为单位报告，液体样品以CFU/ml才为单位报告。 8 . 2 最近似值（MPN）测定法 8 . 2 . 1 适用范围

此方法适用于污染程度低的样品，检验含有受损伤的肠球菌的加工食品及肠球菌菌数小于等于10 CFU/g(ml）的水和食品。 8 . 2 . 2 接种

根据样品污染情况，选择3 个适宜连续稀释度的样液，分别吸取1 mL 稀释液，接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，每个稀释度加3 管。接种量为1 ml 时，使用功ml单料管；对于低污染样品，将10 mL最低稀释度的样品液加到等体积的双料培养基中。 8 . 2 . 3 培养

接种后的肠球菌肉汤置35℃士2℃ 培养24h 士2h ，肉汤颜色变为黑色的试管，表明有肠球菌生长。一般有肠球菌生长时，肉汤颜色在2h 内即可变为黑色。

接种后的叠氮化钠葡萄糖肉汤置36℃士1℃ 培养24h士2h，检查各试管混浊情况。若无混浊，继续培养至48h 士2h 后记录结果。 8 . 2 . 4 确证试验

8 . 2 . 4 . 1 对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤管或颜色变为黑色的肠球菌肉汤管进行确证试

验。用接种环将各管的培养物划线接种于KF 平板或肠球菌琼脂平板。KF 平板置36℃士1℃ 培养48h士2h；肠球菌琼脂平板置35℃士2 ℃ 培养24h 士2h 。

8 . 2 . 4 . 2 肠球菌属细菌在KF 平板上形成暗红至粉红色菌落，边缘整齐；在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。用灭菌接种针从KF 平板或肠球菌琼脂平板挑取10 个可疑菌落，按8 . 1 . 5 所述进行确证试验。 8 . 2 . 5 最近似值MPN

8 . 2 . 5 . 1 如一管培养物中所挑取的典型菌落中，有一个菌落确认为肠球菌，则该管应视为阳性。 8 . 2 . 5 . 2 根据接种的样品量和确证为肠球菌的阳性反应管数，查MPN 值表（参见附录B) ，得出样品中肠球菌最近似值。 8 . 2 . 6 结果报告 肠球菌MPN/g(mL）。

附录A （资料性附录）培养基

A . 1 叠氮化钠葡萄糖肉汤 A . 1 . 1 成分 牛肉浸膏 4.5g 胰蛋白脉15.0g 葡萄糖7.5g 氯化钠7.5g 叠氮化钠0.2g 蒸馏水1000.0mL A . 1 . 2 制法

将上述各成分混匀，不断搅拌加热溶解。每管分装10 mL , 121 ℃ 高压灭菌15 min，调节pH至7.2。若制备双料浓度的叠氮化钠葡萄糖肉汤，可将上述配方蒸馏水改为500ml。 A . 2 肠球菌肉汤 A . 2 . 1成分 胰蛋白胨17.0g 牛肉浸膏3.0g 酵母浸膏5.0g 牛胆粉10.0g 氯化钠5.0g 柠檬酸钠1.0g 七叶苷1.0g 柠檬酸铁铵0.5g

叠氮化钠0.25g 蒸馏水1000.0ml 2 制法

将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.1 士0.2，分装，121℃高压灭菌15min，备用。 A . 3 KF 链球菌琼脂

A . 3 . 1 成分蛋白脉酵母浸膏氯化钠甘油磷酸钠麦芽糖乳糖琼脂 蛋白胨 10.0g 酵母浸膏10.0g 氯化钠 5.0g 甘油磷酸钠10.0g 麦芽糖20.0g 乳糖1.0g 叠氮化钠0.4g 琼脂20.0g 蒸馏水1000.0ml A . 3 . 2 制法

将各成分加热溶解，用10％的碳酸钠调整pH 值至7.2,121℃高压灭菌15 min ，冷却至50℃ ~ 60℃时加人无菌1 ％氯化三苯四氮唑水溶液10 mL 。 A . 4 肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂） A . 4 . 1 成分 胰蛋白胨17.0g 牛肉浸膏3.0g 酵母浸膏5.0g 牛胆粉10.0g 氯化钠5.0g 柠檬酸钠1.0g 七叶苷1.0g 柠檬酸铁铵0.5g 叠氮化钠0.25g 琼脂13.5g 蒸馏水1000.0ml A . 4 . 2 制法

121 ℃ 高压灭菌15 min ，灭菌后调节pH 至7 . 1 ，于45℃ ~50 ℃ 保温培养基，从保温开始至倾注平板的时间不要超过4h 。 A . 5 胆汁七叶苷琼脂 A . 5 . 1 成分 蛋白胨8.0g 胆盐20.0g 柠檬酸铁0.5g 七叶苷1.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000.0ml A . 5 . 2 制法

将各成分加热溶解, 121 ℃ 高压灭菌15 min ，调节pH 至7 . 1 士0 . 2 。冷至45 ℃~50 ℃ 倾注平板。

A . 6 脑心浸液肉汤（BHIB) A . 6 . 1 成分 牛脑浸出粉10.0g 牛心浸出粉9.0g 胰蛋白胨10.0g 葡萄糖2.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钠2.5g A . 6 . 2 制法

将各成分加人蒸馏水中，加热溶解，调节pH 至7.4士0 .2，分装，121℃高压灭菌15min。 A . 7 含6.5 ％氯化钠（NaCl）脑心浸液肉汤 A . 7 . 1 成分

除加人氯化钠（NaCl)，其余成分与BHIB相同。 A . 7 . 2 制法

每升BHIB中加60.0g 氯化钠（NaCl) ，其余制法与BHIB 相同。 A . 8 脑心浸液琼脂 A . 8 . 1 成分

除每升BHIB 加15.0g琼脂，其余成分与BHIB 相同。 A . 8 . 2 制法

称取52g 无水BHIA 溶于1 000 mL 蒸馏水中，加热溶解，每管分装10mL ,121℃高压灭菌15min，

制备成斜面，调节pH至7.4士0.2 。 A . 9 缓冲蛋白胨水 A . 9 . 1 成分 蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钠9.0g 磷酸二氢钾1.5g 蒸馏水1000.0ml A . 9 . 2 制法

按上述成分配好后，调节pH 至7.2 ，每瓶分装225ml , 121℃ 高压灭菌15min 。

附录B （规范性附录）

1g样品中最近似值（MPN ）表 表B .1 1.0g品中最近似值（MPN）表

阳性管数／（g/mL ) 0.1 0.01 0.001 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 <3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 MPN 阳性管数／(g/mL ) 0.1 0.01 0.001 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 MPN 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 15 20 24 16 20 24 29 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 150 230 290 240 640 1100 >1100 注：表内所列样品量如改为1g（ml）,0.1g(ml),0.01g(ml)时，表内数字应相应降低10倍；如改为0.01g（ml）,0.001g(ml)0.0001g(ml)时，则表内数字相应增加10倍，其余可类推。