主国些直瘟堂盘查2鲤§生』旦垫旦箜2§鲞筮3翅£!也』垦!鱼!坐i!!:丛型2Q,2Q竖:y!12』。盟!:≥・实验研究・甲状腺功能亢进对大鼠中枢神经系统Ⅱ型脱碘酶mRNA表达的影响石峰刘春蓉李兰英臧晓怡【摘要l陈祖培目的观察甲状腺功能亢进(甲亢)大鼠中枢神经系统Ⅱ型脱碘酶mRNA(D2一mRNA)的表达。方法将Wistar大鼠分为对照组和甲亢组,甲亢组采用40以甲状腺素灌胃。连续3周后定量荧光RT_PCR技术分析甲亢大鼠大脑、小脑、海马、脑干和脊髓中D2一mRNA表达的变化。结果甲亢大鼠大脑、小脑、海马、脑干和脊髓的D2一mRNA的表达均被抑制,与对照组比较,分别下调22.21%、45.57%、31.56%、34.79%、85.10%。结论甲亢时大鼠中枢神经系统的D2在转录水平受到抑制,说明D2对中枢神经系统自稳态的调节起着重要的作用。【关键词】The脱碘酶;神经系统;甲状腺功能亢进;大鼠studyonthe麟p№ssi仰of略pe2iodothyroI-iIledeiI蛐嘛semRNAinhyperthymidmt∞nt均l耻rv0吣systems日¨1e昭,L彤吼Ⅱ凡一ro愕,u£m—归峪,z哇^rGx洳一∥,c日EⅣ氖-peiobjectiveTodetecttIleexpressionof‰疵M≠e0,曲勘cri∞研,gmup.The‰彬流胁d记以‰劫e倦蚵,‰呵流砌如70,仍i№【Abstract】cent阳lnen,oustype2iodotIlymninedeiodinasemRNAinhyperthymidsystem.Me缅odsWisterrat8weredividedintono珊algroupandhypenh),rojdexpressionoftype2deiodinaseincerebnlm,cerebellum,hippocampus,brainstemandspinalcordofhyperthyroidbyreal—timePCRafter3weeksAttranscriptionalmtswasmeasuredgmup.intmgastricadministrationof40g/Lexpressionoftype2tetraiodothymninefordeiodinasewasratshyperthymidobviouslyResllltsinlevel,theiodothyroninecordinhibitedcerebmm,cerebeⅡum,hippocampus,bminstemandspindofhyperthyroidcomparedwiththoseofno肌alThecontmlgroup,decreasingby22.21%,45.57%,31.56%,34.79%and85.10%,inthecentralnenrousrespectiVely.Conclusionsistype2iodothymninedeiodinaseindicatingthatsystemofhyperthymidanratsinhibitedattranscriptionallevel,type2iodothymninedeiodina8eplaysimportantroleinadjusting山ehomeostasisofcentralnen,ou8system.Hypenllymidism;Rats【Keywortls】Deiodinase;Nenroussystem;甲状腺功能亢进症(甲亢)系指由多种病因导致甲状腺激素(TH)分泌过多引起的临床综合征。甲亢除有高代谢症候群外还伴有精神、神经症状[1]。中枢神经系统(CNS)不直接利用血循环中的T,,大脑皮质80%结合的B主要是在星型胶质细胞胞浆中由T4生成的,Ⅱ型脱碘酶(D2)催化T4向T3的转变,从而保证CNS中有足够的B在其发育及生理功能中起关键作用。D2的活性在甲状腺激素水平改变时出现快而显著的变化,但甲状腺激素在转录水平对脑D2调节的定量分析却少有报道。本实验基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30230330);天津市科委自然科学基金资助项目(033605711)作者单位:300070天津医科大学内分泌研究所作者简介:石峰(1980一),女,内蒙古巴彦淖尔市人,硕士研究生,从事激素与发育、甲状腺疾病的研究(Email:shifen酣26@eyoILcom)应用定量PCR技术分析了甲亢时大鼠CNSD2一mRNA的表达变化,可为进一步认识CNS自稳态的调节以及甲亢伴发精神、神经症状的机制提供重要的实验依据。1材料与方法1.1实验动物及分组:Wistar大鼠(无特异病原体.军事医学科学院实验动物中心提供)20只.体质量150~180g,雌雄各半,随机分为实验组和对照组,每组10只。参照陈小野[21动物模型制作方法,将甲状腺素片(上海长城生物制药厂)研末,用生理盐水配成40g/L混悬液。实验组每只大鼠1ml/d,灌胃给药,连续3周。对照组每天等量生理盐水灌胃。饲养3周后称体质量,1%戊巴比妥钠麻醉动物,股动脉取血,离心后取上清,放射免疫分析法检测血清游离三碘甲腺原氨酸(飓)、游离甲状腺素(甩)水平。断头取脑,将大脑皮质、小脑、脑干、海马及脊髓通信作者:李兰英(E眦il:lilv@tiimu.edu.cn)万方数据 生垦垫直痘堂苤查2Q竖生§旦垫旦筮2§鲞箜3塑£h鱼』星坠鱼!查!!:丛型2Q:!Q竖:!丛2§,盟!:!分别保存于液氮中。养16h,碱法小量提取重组质粒,&oRI和RtI双1.2大鼠各脑区RNA的提取及cDNA的合成:各酶切鉴定。将含有重组质粒的菌液交由上海博亚公脑区取组织100mg,用TRIzol试剂(美国GIBCO司测序同时中量提取重组质粒(上海博大泰克公公司)按试剂盒所述方法提取总RNA,利用紫外分司)。测定重组质粒提取物A狮,换算成重组质粒的光光度法对其定量。甲醛变性凝胶电泳对RNA定拷贝数[拷贝数=质量(g)×6.023×10可(660×性。取3斗g总RNA利用反转录系统(美国Promega碱基数)],梯度稀释得到的拷贝数分别为1014、1013、公司)反转录为cDNA,一20℃保存。10n、1011、1010、109/L,从而得到D2及GAPDH各自的1.3普通PCR:扩增D2及内参3一磷酸甘油醛脱氢定量PCR标准品,分装成小管,避免反复冻融。标准酶(GAPDH)。引物序列见表1(上海博亚公司),反品的鉴定:‰Mar一探针5’端带有荧光物质应体系总体积为20IIll,其中含dNTP、MgCl2、10×(FAM),3’端带有荧光淬灭物质TAMRA(上海博亚buffer、上下游引物、cDNA。PCR反应条件为:预变性公司合成),探针序列见表1。反应体系总体积为95℃5min;循环变性94℃30s,60℃30s,72℃20ml,其中含dNTP、MgCl2、10×bu能r、上下游引30s,30个循环;72℃延伸5min。PCR仪(英国物、探针、重组质粒。定量PCR程序为:95℃5min;Hvbraid公司)扩增。94℃15s,63℃40s,40个循环,在定量PCR仪上1.4定量PCR标准品制备及鉴定:利用PCR产物扩增(瑞士Roche公司),检测标准曲线的相关性。胶回收试剂盒(北京博大泰克公司)从1.5%琼脂糖1.5样品检测:分别取实验组和对照组cDNA,与凝胶中回收纯化D2及GAPDH目的片段。将目的标准品一起在定量PCR仪上扩增,从而得到各组样片段与PMD一18T载体16℃循环水浴过夜连接。转品中D2一mRNA及GAPDH—mRNA的浓度。扩增条化人Topl0感受态菌中,联合用a互补法和氨苄青件与标准品一致。霉素筛选法筛选转化后的菌株。挑取白色菌落数个1.6数据分析:样品D2校正值=D犹APDH,统计至含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培学分析采用t检验。表1PCR引物和砌Man删探针序列TaMe1PCRprimerand砌Man删pmbe2结果意义(£=7.20,P<0.01);血清飓、n显著升高,与2.1大鼠体质量和血清n、、n:3周后,甲亢组大对照组比较,差异有统计学意义(t值分别为12.90、鼠体质量明显下降,与对照组比较,差异有统计学15.58,P<0.01)。见表2。表2各组动物实验前后体质量变化及血清FT.3、FT4水革(面±s)TaMe2.11把棚脓肌mc档betwe蚰of鲫r啪FT3,Fr4levdbe胁阳andafter以pe—m蛐tjn船chgroups(面±s)注:与对照组比较,++P<O.012.2定量PCR结果曲线:PCR曲线扩增过程成指2.3大鼠中枢神经系统D2mRNA表达:甲亢组大数上升。曲线陡赢.进入平台期后各样品基本在同鼠大脑、小脑、海马、脑干、脊髓中D2一mRNA的表一水平,说明PCR系统误差小,见图l。各梯度起始达明显低于对照组。下调范围分别为2221%、45.57%、循环图数(CT)值之间的间隔相等,各梯度均能在一31.56%、34.79%、85.10%,二组比较差异有统计学条直线上,标准曲线的相关系数(r)为0.990±0.005,意义(t值分别为8.378、14.240、5.613、10.532、提示误差较小,可信度较高,见图2。54.685,P<0.01)。见表3。万 方数据史旦丝友疸堂盘鲞2Q竖堡§旦2Q旦笠21鲞箜3塑gh也』E娶d!墅i尘:丛业2Q:2Q竖,y尘25。盟!:3图l荧光定量PCR标准品及样品扩增结果图2荧光定量PCR标准曲线n鲫地lFl呻res∞nceq岫嘣taⅡvePCRstaIIdardn印m2耵∞m∞encequ蛐廿ta6vePCRst柚dardU眦and鲫哪pIe珊砌ts表3大鼠中枢神经系统D2一mI斟A表达(哥±s)Fig叫e3E骶ctsof蛔perthyroidismonratD2mRNAleVelS(面±s)注:与对照组比较,料P<0.0l3讨论转录水平的表达。而甲低时D2一mRNA的表达增D2是提供脑中T3主要来源的途径,在保持加【7],表明甲状腺激素不仅影响D2的活性,同时影CNS中相对稳定的甲状腺激素水平中起着重要的响其mRNA的表达。CNS中的T3的水平主要靠局作用。大脑中的T3不仅由星形细胞提供,还有小部部的酶来调节。甲亢时高水平的甲状腺激素可导致分通过血一脑脊液屏障中的T4脱碘直接提供【3]。在D2一mRNA的表达减少从而减少脱碘酶的生成。活星形细胞和伸展细胞中.D2一mRNA存在于细胞突性降低,使脑中T3生成减少,从而达到保护脑组织起中的量大于细胞体中的表达量。伸展细胞分布在的作用。同时脑脊液中T4在TSH合成和释放的反第三脑室周边。是组成血一脑屏障的一部分,其短突馈调节中也起着非常重要的作用,通过抑制TSH达起从脑脊液和血液中接受T4和T3并最终通过长突到自我保护作用。起输送给下丘脑T3;星形细胞也是血一脑屏障的成CNS的结构和功能很复杂。不同脑区的功能及分,其突起一部分围绕在血管周围。另一部分与神基因表达的特点亦不同。甲亢的精神、神经症状是经元建立联系,通过这种方式接受血液中的T4并经不同脑区损伤共同导致的综合症状,致病及调节过过脱碘转化为T3后,传递给神经元…。D2还可通过程非常复杂.实验证明在甲亢时CNS中D2一mRNA甲状腺激素调节垂体的促肾上腺素皮质激素的释的表达一致下调。在CNS的自稳态调节中起着重要放从而调节特定区域的生长发育瞪]。D2在大鼠和人的作用,这有助于了解甲亢导致精神症状的调节机的表达有不同范围,共同点有CNS、垂体、棕色脂肪制,但要彻底阐明其发生机理还需进一步研究。和胎盘内部,人的甲状腺、心肌和骨骼肌也有表达,参考文献大鼠未发现。D2催化5’外环脱碘作用使T4转变为1刘微,熊吉东,陶永红,等.甲状腺功能异常伴发精神障碍的I临床T3。D2相对分子质量为29×103,是一种膜整合蛋分析[J].中国地方病学杂志,2003,22(3):262.263.白,其一NH:端位于内质网,一COOH端伸向胞质,2陈小野.实用中医证候动物模型学[M].北京:中国协和医科大这种结构比I型脱碘酶(D1)更利于T4的脱碘陆]。在学联合出版社,1993.169.3Verhoelst甲状腺功能有变化时,以D2活性改变为主。CH,D锄sVM,RoelensSA,eta1.’rype2iodothyroninedeiodinasepIDteininchickenchorDidplexus:additional许多研究已证实甲亢时D2的活性下降,甲状pel3pectiVesonT3supplyintheavianbrain[J].JEndocrinol,腺功能低下(甲低)时增强[71。但在甲亢时,在转录水2004,183(1):235.241.平的研究报道较少,本实验采用定量PCR技术检测4Guada0一FerrazA,Mo玎eakdeEscobarG,DeViiLder,eds.The这些甲亢大鼠的CNS的各脑区,发现在大脑、小脑、mleofdeiodinasesduringbraindevelopmentre西on-specificexpressionoftype2andtype3deiodin船esduringbrain海马、脑干和脊髓中D2一mRNA的表达与对照组比development[A].In:MorTealedeEscobarG,deV玎lderJ,ButzS,ed&较均下降,说明高水平甲状腺激素抑制CNSD2在nethyroidaIldbrain[M].NewYork:Schattauer,2003.161—173.万 方数据主圄垫直疸堂苤查2Q竖生§旦2Q旦筮2§鲞筮3塑g丛!』垦!鱼!塑丛:丛型!Q,塑鱼:Y尘21:盟!:1・253・5Amki0,MorimuraT,OgiwaraT,eta1.Expressionoftype27Bu珊eisterLA,PachuckiJ,StGe珊ainDL.rnlymidho咖onesiodothymninedeiodin鹊eincorticotmphin—secretingmousepituitaryiIlIlibittype2iodothyroninedei础naseintheratcerebralcortexbytumorceusisstimulatedby西ucoconicoidandcorticotropin—bothpre・alldpost-traIl幽瞳ionalmechaIIisms[J].Endocrinolo盱,rele船inghonIIone[J].Endocrinology,2003,144(10):4459—4465.1997,138(12):5231-5237.6BlancoAC,SalvatoreD,GerebenB,eta1.Biochemistry,cellularandmolecularbiology,aIldphysi0109icalrolesoftheiodothymnine(收稿日期:2005一06.25)selenodeiodin船es[J].EndocrReview,2002,23(1):38-39.(本文编辑:王丹娜)・简报・喉返神经显露在甲状腺手术中的意义温济民【关键词】喉返神经;甲状腺切除术;并发症喉返神经损伤是甲状腺手术主要并表1甲状腺肿物性质发症之一。为了防止喉返神经损伤,作者自2002年开始进行甲状腺切除术野显露喉返神经的效果观察.结果表明,甲状腺切除术中显露喉返神经能有效防止其损伤及预防永久性声带麻痹的发生,现损伤。未显露组30例,有2例出现喉返损伤机会。而体积较小结节性甲状腺肿・将观察结果报告如下。神经损伤。两组之间比较,差异有统计学和甲状腺功能亢进、单纯的甲状腺腺瘤。1资料与方法意义(x2=4.82,P<0.05)。行甲状腺次全切除术体积不大的甲状腺1.1临床资料:甲状腺疾病患者58例,3讨论无需常规显露喉返神经。手术中显露喉男性28例,女性30例,年龄25—70喉返神经损伤是甲状腺手术的严重返神经的长度应根据病变而定,对于甲岁.平均46.8岁。显露喉返神经组28并发症和潜在性引起患者严重病残的并状腺上极良性病变只需暴露甲状腺下极例.男性12例,女性16例。未显露组30发症…。传统观点认为:切除甲状腺腺体处一段神经.利于术中切除病变组织时时.不显露喉返神经,只要在甲状腺被膜估计喉返神经的位置;对于甲状腺恶性例,男性14例,女性16例。术前常规甲状腺B超检查,提示实质性肿物30例,内操作,保留少许腺体背侧的被膜组织,肿瘤及部分巨大甲状腺良性病变作甲状囊实性肿物18例,囊性肿物10例。分型多能避免损伤喉返神经[2]。随着甲状腺腺全切或次全切除术时,需将喉返神经见表1。外科的发展.越来越多的学者主张解剖显甲状腺段全部解剖,边解剖神经边切除1.2手术方法:未显露组按常规甲状腺露喉返神经是保护喉返神经最安全有效病变。达到既彻底切除肿瘤又不损伤喉手术保护喉返神经行经区的神经.保持的方法口].本组的治疗经验也支持这点。返神经。通过I临床观察手术结果显示,显腺体背部的完整。显露组在侧叶背面寻喉返神经损伤的原因大致有以下6露喉返神经组喉返神经损伤的发生率明找到甲状腺下动脉。在下动脉深面沿气种情况:①肿瘤或多次手术使周围组织显低于未显露喉返神经组。所以说术中管食管沟由浅入深分离.发现银灰色线黏连导致解剖关系不清:②术者对喉返恰当地显露解剖喉返神经安全、可靠,值状组织.追踪至环甲膜人喉处可确定为神经的解剖路径不熟;③手术粗糙,止血得提倡。喉返神经。然后仍然紧贴甲状腺结扎甲不彻底。术中盲目慌乱钳夹,其中发生于参考文献状腺下动脉的分支。避开喉返神经行甲甲状腺下动脉以及其分支跨喉返神经入1ReaJL,KhanA.Clinicalevoked状腺腺叶切除术或次全切除术。显露喉喉动脉出血尤易致神经损伤;④误将喉electmmyographyforrecurrentlarynge8l返神经的长度根据病变而定,对全甲状返神经当作甲状腺下动脉而损伤;⑤喉nervepreservation[J].L唧ngoscope,1998,腺或次全甲状腺切除,需要全程暴露神返神经解剖变异;⑥由于对甲状腺及甲108(12):1418—1420.经以确保喉返神经免受损伤。状旁腺或颈部淋巴结的病理导致喉返神2ProcacciaJlteF,Pico商P,P∞ificiM.1.3统计分析:数据分析采用)(z检验。经的行经发生偏移情况缺乏了解。Palpalmymethodu8edtoidentifytherecun℃nt2结果预防上述情况发生的关键是:充分laryngealneⅣeduringthymidectomy[J].Wodd显露组中的28例患者,无喉返神经掌握喉返神经的解剖特点.术中适时恰JSurg,2000,24(4):571・573.3JatzkoGR,LisboryPH,MullerMG,eta1.当地解剖喉返神经。对于甲状腺手术中Recurrentnervepalsyafterthyroid作者单位:536000广西壮族自治区北海喉返神经的显露应根据具体的情况,对叩emtion:principalnerveidentificationand市人民医院普外科于甲状腺体积较大、胸骨后甲状腺肿、多aliteraturereview[J].SurgeIy,1994,115(2):作者简介;温济民(1970一),男,黑龙江省次甲状腺手术、甲状腺肿瘤时,需行甲状139.144.哈尔滨市人,硕士,副主任医师,从事普外科腺全切除术、体积较大的甲状腺次全切(收稿日期:2005.07.25)疾病临床治疗除术显露喉返神经可以减少喉返神经的(本文编辑:王丹娜)万 方数据