2007年1月
海 洋 与 湖 沼
OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA
Vol138,No11Jan.,2007
中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)与生长
3
性状相关SCAR标记的筛选
何玉英 刘 萍 李 健 王清印
(中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)
①
提要 采用RAPD技术对“黄海1号”中国对虾快速生长选育群体第6代大个体群体(CP2a)
和小个体群体(CP2b)以及野生群体(WP)为对照组的各50尾个体进行扩增,获得可能与生长性状相关的9个RAPD遗传标记。对获得的标记进行克隆、测序并根据序列设计特异性引物对3个群体进行SCAR标记分析。其中6对引物(SCAR1、SCAR2、SCAR3、SCAR4、SCAR5和SCAR6)在3个群体中有扩增产物,前4对引物在3个群体共150尾个体中的扩增产物无多态性。SCAR5和SCAR6在3个群体中的扩增产物具有多态性。依据扩增产物在群体中出现的频率和变化规律进行分析表明,SCAR5扩增的多态片段在3个群体中的组成比例分别为78%、52%和54%,差异显著(P<0.05);SCAR6扩增的多态片段经电泳后产生3个等位基因,6种基因型,只有CP2b含有等位基因A。这2个标记可以作为与中国对虾生长性状相关的候选标记,为在生产实践中实行分子标记辅助育种奠定理论基础。关键词 SCAR,RAPD,中国对虾,生长性状中图分类号 Q78中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)是黄、渤海的主要经济虾类,具有较高的经济价值。在养虾业发展盛期(1990年前后)曾占到我国对虾养殖产量的70%。1993年以后,由于品种、病害和环境等因素的影响,养殖产量急剧下降,只占全国对虾养殖产量的1/3。由于缺乏良种,对虾养殖的苗种繁育只得依赖野生亲体。随着养殖世代的增加,出现了遗传多样性减少、生长速度减缓、抗逆能力下降等问题。培育生长速度快、抗逆能力强的新品种成为目前对虾养殖业急需解决的问题。目前中国对虾的选择育种大多是从形态及表型性状进行选择,但形态及表型是遗传因素和环境因素相互作用的综合结果,表型的变异并不能完全或真实地反映遗传变异,因此可信度不高。目前最可靠的方法是运用分子遗传标记的方法进行标记辅助选择(MarkerAssistedSe2
lection,MAS)。MAS不受微环境变化的影响,也
可以在生物的早期发育阶段进行选择,从而增加了选择的准确性并缩短时间间隔。
SCAR(Sequence2CharacterizedAmplifiedRe2gions)分子标记是由Paran等(1993)提出并应用的,是根据RAPD分子标记的序列分析结果设计较长的特异性引物(一般为22—28个碱基)进行PCR扩增得到的,因此特异性和重复性较好。SCAR分子标记另一个优点是其标记可能是共显性的(Paranetal,1993)。目前SCAR分子标记已广泛应用于鱼类不同品种的鉴别(Bardakcietal,1999)、昆虫的分类学及群体生物学(Damodaretal,2003)以及农作物的种质资源鉴定(Behuraetal,1999)等,但在对虾研究领域尚未见报道。本试验中作者开展了将中国对虾的RAPD标记转换为SCAR标记的研究工作,以期筛选与生长性
3国家自然科学基金项目资助,30271038号;山东省自然科学基金项目资助,Y2002D02号;国家科技攻关项目资
助,2004BA526B0101号。何玉英,助理研究员,E2mail:heyy@ysfri.ac.cn
①通讯作者:李 健,研究员,E2mail:lijian@ysfri.ac.cn收稿日期:2005209222,收修改稿日期:2005212212
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1期何玉英等:中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)与生长性状相关SCAR标记的筛选 43
状相关的遗传标记为今后生产实践中实现标记
辅助选择奠定基础。
1.5 特异性引物的设计及PCR反应
1 材料与方法
1.1 试验动物
试验动物来自本所选育的快速生长群体“黄
海1号”中国对虾的第6代群体。根据建立的中国对虾体长正态分布图,淘汰90%中间类型,将生长高值和低值两种极端表型的个体区分开来,分成两个群体。其中体长15cm以上的个体为CP2a群体;体长11cm以下的个体为CP2b群体。同时以海捕的野生群体(WP)为对照组(体长在10—14cm之间),进行研究。每个群体各取50尾,在取样地点将新鲜样品速冻,运回实验室后-70℃保存。1.2 基因组DNA的提取
DNA提取和定量的方法参照刘萍等(2000)。1.3 基因组DNA的RAPD分析
根据测序序列利用引物设计软件Primer
Premier5设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,对3个群体进行扩增。
μl:模板DNAPCR扩增反应的总体积为25
(50ng/μl),2μl;10×Buffer(KCl,500mmol/μl,
μl,pH9.0;Tritonx2Tris2HCl,100mmol/100,1%),
μl;Mg2+(15mmol/μl),2μl;dNTP(分别为2.5
μl),2μl;引物(10pmol/μl)各2μl;Taq2.5mmol/
μl),0.2μl;用双整水补充至25μl。酶(5U/
每个反应过程为30个循环,一个循环包括94℃40s,退火1min,72℃1min。首次循环前先在94℃预变性5min,最终在72℃充分延伸5min。产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离。EB染色后,紫外灯下观察拍照。
2 结果2.1 中国对虾的RAPD遗传标记分别将3个群体的单个DNA样品等量混合组成DNA池(DNApools)。首先以DNA池为模板对3个群体进行分析,然后对在混合模板分析中产生特异性条带的引物做群体分析,通过计算特异性条带在群体中的比例来判断其与中国对虾生长性状的相关性。作者采用S系列的240个引物(S101—S280及S401—S460)对中国对虾的3个群体进行扩增。
μl,其中:模板PCR扩增反应的总体积为25
μl)2μl;10×DNA(10ng/Buffer(KCl,500mmol/
μl,Tris2μl,pH9.0;Tritonx2HCl,100mmol/100,
μl;MgCl2(Mg2+浓度为15mmol/μl)2μl;1%)2
μl)2μl;引物(15pmol/dNTP(分别为2.5mmol/
μl)1μl;TaqDNA聚合酶(上海生工公司生产)
μl。1U;用双蒸水补充至25
每个反应过程为45个循环,一个循环包括94℃1min,37℃1min,72℃2min。首次循环前先在94℃预变性5min,最终在72℃充分延伸10min。每次反应均设置不含模板DNA的空白对照。RAPD产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离,
μg/ml)染色,紫外灯下溴化乙锭(EB,浓度为0.5
观察拍照。
1.4 特异性条带的提纯、克隆及测序
通过对混合模板的分析(图1),筛选出可能
与生长性状相关的特异性扩增带65个,其中正相关a的扩增带55个,负相关的扩增带10个。
图1 引物S186和S187对混合模板的扩增电泳图
Fig.1 ElectrophoretogramsofS186andS187
frommixedtemplates
注:箭头所示为筛选的特异性扩增带。单位为bp。泳道1、2、3为S186扩增电泳图;泳道4、5、6为S187扩增电泳图。泳道1和4采用的混合模板来自WP,2和5来
自CP2b,3和6来自CP2a。M为MarkerDL22000
将获得的RAPD遗传标记采用上海生工公
司生产的UNIQ210柱式DNA胶回收试剂盒进行回收和提纯,交由上海博亚公司进行克隆测序。
对筛选出的RAPD引物做群体分析(图2),找到9个可能与生长性状相关的遗传标记,其中正相关标记7个,负相关标记2个。遗传标记的分子量范围在500—1500bp之间。表1给出了9个标记在3个群体中的组成比例。
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44海 洋 与 湖 沼38卷
图2 引物S173在CP2a、CP2b和WP的扩增电泳图谱
Fig.2 ElectrophoretogramsofS173inCP2a,CP2bandWPofF.chinensisa:CP2a;b:CP2b;c:WP。箭头所示为RAPD遗传标记。单位为bp
表1 9个标记在3群体中的多态比例
Tab.1 PolymorphicproportionsofninemarkersinCP2a,CP2bandWP
引 物
CP2a
S105S124S157S159S173S203S203S214S265
80.060.073.033.386.742.656.733.353.3
CP2b33.326.753.346.766.733.393.313.333.3
WP36.733.340.033.346.726.760.016.540.0
特异性扩增带在3群体中比例(%)
2.2 RAPD标记的克隆、测序S159扩增的特异片段不能被克隆、测序以外,其
得到的9个RAPD标记经回收和提纯后,由上海博亚公司克隆测序。测序结果表明,除引物
他8个RAPD标记均获得完整的序列,获得的序列片段长度在558—1024bp之间(表2)。
表2 RAPD标记的引物及序列长度
Tab.2 PrimersandsequencelengthofRAPDmarkers
引 物
S105S124S157S173
序列长度(bp)
7558239961007
引 物
S203S203S214S265
序列长度(bp)
7365581024860
2.3 SCAR标记的筛选
根据8个标记的测序序列,分别运用软件
PrimerPremier5设计特异性引物,运用合成的引
物,对CP2a、CP2b和WP各50个个体进行SCAR标记分析。扩增结果表明,在设计的8对引物中,根据RAPD引物S173和S214获得的标记合
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成的2对引物在3个群体中产生的条带弱,特异性较差,故不再继续进行试验。其他6对引物在
3个群体中均获得了特异性强且稳定的条带(表3),其中引物SCAR1、SCAR2、SCAR3和SCAR4
获得的特异性条带在3群体共150个个体中均有扩增产物,故无多态性。引物SCAR5和SCAR6在3个群体中获得的特异性条带具有多
对虾生长性状进行选择的候选遗传标记。
引物SCAR6对CP2a、CP2b和WP3个群体进行扩增,扩增产物经电泳后,共产生3个等位基因,6种基因型(图4),将最长的特异片段定为等位基因A,较长片段定为等位基因B,最短片段定为等位基因C,3个群体的基因型和基因频率见表4。
态性。
引物SCAR5对CP2a、CP2b和WP3个群体进行扩增,获得一条长约500bp的多态性片段(图3)。其中在CP2a中有39个个体扩增出多态片段,CP2b中有26个个体扩增出多态片段,而WP的50个个体中有27个个体扩增出多态片
段,多态片段在3个群体中的组成比例分别为78%、52%和54%,在CP2a中出现的频率最高。
卡方(χ)检验表明,多态片段在CP2a和WP之间的组成比例差异显著(P<0.05),可作为对中国
2
图4 SCAR6在CP2b中的扩增电泳图谱Fig.4 ElectrophoretogramsofSCAR6inpopulationCP2b
单位为pb由表4可以看出,WP和CP2a两个群体不存在等位基因A,只有CP2b存在等位基因A,CP2b是“黄海1号”中国对虾选育第6代的小个体群体,因此,等位基因A可能与个体生长速度有关,可作为对中国对虾生长性状进行选择的候选遗传标记。
3 讨论
标记辅助选择是根据与某一性状或基因紧密连锁的标记的出现来推断该基因或性状从而进行选育的方法。MAS不受环境变化的影响,直接从分子水平进行研究,是对基因型选择最为重要的方法,尤其适用于遗传力低的性状。借助分子标记,通过影响选择的时间、选择的强度及选择的准确性,来间接控制选择某些性状的数量性状座位(QTL),而找到与QTL相连锁的分子遗传标记是实现MAS的关键。目前标记辅助选择技术已广泛应用于畜牧业(Montgomeryetal,1993;Otsuetal,1992;Georgesetal,1993),在鱼类方面
的研究也有报道(Paltietal,2003;李志忠等,2000)。
对虾养殖是我国海水养殖业中最具有代表
图3 引物SCAR5在3群体中的扩增结果
Fig.3 Electrophoretogramsofdifferentialfragmentby
SCAR5inthreepopulationsa:CP2a;b:CP2b;c:WP。单位为bp
性的一个产业,对虾养殖业的发展方向是在原有品种的基础上进行遗传改良和培育新的优良品种。但在选育过程中传统的遗传选育和改良技术存在许多缺陷,如选育效果低、所需周期长等。
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表3 试验所用6个SCAR标记的引物序列及退火温度
Tab.3 AnnealingtemperatureandprimerssequencesofthesixSCARprimers
RAPD引物S124S157S203S265S105S203
38卷
特异性引物编号
SCAR1SCAR2SCAR3SCAR4SCAR5SCAR6
退火温度(℃)
565056555660
)引物序列(5′—3′
F2′GAAAGAATACGGCAGAATA′R2′TTTGACATCGTGCGTTGAG′F2′CTCATCCCTGCGGCTTAT′R2′GAGTAATGGAGGAAACGA′F2′TATGGAAGAGCATTGTGGC′R2′TCCCTGGATTTATCTCCTACT′F2′AGGATGAGGGGAAGAAAGA′R2′AACTCCTCAACTCGCAGAA′F2′CTTACATTTTCGTTCATTC′R2′AGTGTCGCTTGGAGATTGG′F2′CAGGCGTTCAGTGGTCAGG′R2′CAGGCGTTCAGTGGTCAGG′
表4 3个群体在该位点的基因型和基因频率Tab.4 Genotypefrequencyandgenefrequencyatthelocusinthreepopulations
群体
CP2aCP2bWP
样品数
AA505050
0.04
BB0.340.220.42
CC0.20.180.22
0.08
0.1
ABAC
BC0.460.380.36
A00.130
B0.570.450.6
C0.430.420.4
基因型频率基因频率
分子标记辅助育种技术可明显提高选育的进度,尤其是对那些通过表型难以度量的性状。目前对养殖对虾主要经济性状的分子标记研究已取得一定的进展。法国海洋开发研究院(IFREM2ER)从蓝对虾(Litopenaeusstylirostris)种群中找到10个微卫星标记,从斑节对虾(Penaeusmonodon)
本试验中,引物SCAR5对CP2a、CP2b和WP进行扩增获得的多态片段在3个群体中的组成比例分别为78%、52%和54%,多态片段在中国对虾大个体群体中出现的频率最高,与对照组野生群体相比,两者差异显著(P<0.05),在生产中可作为对中国对虾快速生长性状进行选择的候选标记。同时说明经过连续6代的选育,中国对虾的遗传结构已发生了一定程度的变化,与生长性状紧密连锁的优利基因不断“富集”。这些变化在表型上表现为个体间的生长性状如体长的差异。引物SCAR6对CP2a、CP2b和WP3个群体进行扩增共产生3个等位基因,6种基因型,对其基因型和基因频率的分析结果表明,WP和CP2a均不含有等位基因A,而只有对照群体CP2b含有等位基因A,这说明该位点可能与抑制中国对虾生长性状的基因相关或连锁。WP不含等位基因A的原因一方面可能是WP群体在该位点上只存在等位基因B和等位基因C,不存在A基因。另一方面可能是在取样过程中,随机取样所取的50
中找到3个微卫星标记,这些标记对识别混养家系发挥了一定的作用。澳大利亚联邦科学和工业研究院(CSIRO)从日本对虾(Marsupenaeusja2
ponicus)中找到3个可能与生长表现相关的基因
位点,并有可能进一步开发为可预测生长的基因标记(王清印等,2001)。美国运用RAPD技术从凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中成功地筛选出一些特异性标记(Carciaetal,1996;Alcivar2Warrenetal,1997)。对中国对虾遗传标记的研究仅限于种群或群体遗传多样性的研究(孟宪红等,2004;马春艳等,2004,何玉英等,2004;张天时等,2005),针对某一性状的特异性标记的研究报道较少(刘萍等,2002;沈琪等,2002)。
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个个体中恰好不含等位基因A。下一步将加大样
本的数量结合中国对虾的生长记录做进一步的相关性分析,对找到的2个标记进行验证,为在生产实践中实现标记辅助育种提供理论依据。
参 考 文 献
马春艳,孔 杰,孟宪红等,2004.中国对虾5个地理群体
的RAPD分析.水产学报,28(3):245—249
王清印,李 健,杨爱国,2001.海水养殖生物的新品种选
育,海水养殖生物病害发生与控制.北京:海洋出版社,137—144
刘 萍,孔 杰,石 拓等,2000.中国对虾黄、渤海沿岸
地理群的RAPD分析.海洋学报,22(5):88—93刘 萍,孟宪红,孔 杰等,2002.对虾抗病性状遗传标记
的RAPD分析.水产学报,26(3):270—274
何玉英,刘 萍,李 健等,2004.中国对虾第一代和第六
代人工选育群体的遗传结构分析.中国水产科学,11
(6):572—575
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48海 洋 与 湖 沼38卷
GROWTHTRAITSRELATEDSCARMARKERSIN
FENNEROPENAEUSCHINENSIS
HEYu2Ying,LIUPing,LIJian,WANGQing2Yin
(YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,266071)
Abstract OverfishingforFenneropenaeuschinensis(Chineseprawn)inrecentyearshascausedseriousproblemsinthegreatshortageofsupplyofqualitybreeds,whichhasbecomeaseriousissueholdingtheaqui2culturefromsustainabledeveloping.Forthesolution,fast2growingandstronganti2diseasebreedsshouldbesought.WeconductedthisresearchinNovember2002bysampling150individualsofthespeciesforRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)studyfromthreegroupsof50;andthelabworkingbeganinJanuary2003.Amongthethreegroups,twoweretakenfromthe6thgenerationofHuanghai2IculturedF.chinensis,in2cludingthetwoextremesofsize:largegroupinlength>15cm(CP2a)andsmalloneinlengths<11cm(CP2b),andthethirdgroupwerecombinedbywildonesinsizebetween11and14cm(WP).Foreachgroup,240randomprimerswerescreenedformixedtemplates.65growthtraitcorrelateddifferentialfragmentswereob2tained,55positiveand10negative.Populationanalysisforthescreenedprimersfrom240RAPDprimersshowed9RAPDprimerswerecorrelatedtothegrowthtraits,7positiveand2negative.Aftercloningandse2quencing,8sequencesinlengthfrom500bpto1000bpwereobtainedexceptthemarkeramplifiedbyS159.UsingPremier5fordesigningspecificprimersandSequence2CharacterizedAmplifiedRegions(SCAR)tech2nique,growthtraitsmarkersofF.chinensisweredetermined.6SCARs(SCAR1—6)wereamplifiable,amongwhichthefirstfourcouldnotdifferentiateamongthethreepopulations,andthelattertwocouldamplifypoly2morphicfragmentsinbandfrequencyandvarietyruleshowninthesamples.Thenumberofpolymorphicfrag2mentsamplifiedbyprimerSCAR5inCP2a,CP2bandWPwas39,26and27,respectively,andthebandfre2quencywas78%,52%and54%,respectively.χtestofpolymorphicfragmentsinCP2aandWPpopulationsshowedsignificantlydifference(P<0.05),indicatingthatthepolymorphicfragmentcanbeusedaspositivemarkercandidate.3allelesand6genotypeswerefoundinthreepopulationsamplifiedbyprimerSCAR6,whileinCP2balleleAonly,showingthatlocusAwasprobablyrelatedtocertaingenesthatcanrestrainthegrowthoftheprawn.Theresultsareusefulinbreed2selectionforproductionenhancementofF.chinensisapplyingmarker2assistedselection(MAS)procedure.
Keywords SCAR,RAPD,Fenneropenaeuschinensis,Growthtraits
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