棉纤维总RNA提取方法的比较与分析

马顺尧;曲延英;高文伟;陈磊;郑炜佳;陈全家

【摘 要】[目的]筛选适合棉纤维总RNA的提取方法,并对其进行改良,以满足转录组和表达谱测序要求.[方法]采用三种方法提取棉纤维总RNA,即改良的热硼酸法、Trizol法和离心柱试剂盒法.[结果]改良的热硼酸法提取的棉纤维总RNA质量最好,同时对该方法的改良更适合不同时期相同棉花品种和相同时期不同棉花品种棉纤维总RNA的提取.[结论]通过比较棉纤维总RNA的提取方法,发现改良的热硼酸法提取棉纤维总RNA质量最好,且对该方法的改良提取的总RNA更能够满足转录组和表达谱测序的要求.%[ Objective ] This study aimed to screen total RNA extraction method for cotton fiber and improve it to meet the

transcriptome expression profiling sequencing requirements. [ Method ] Three methods of extraction of cotton fiber total RNA were used, that is, modified hot borate method, the Trizol method and centrifugal column kit method. [ Result]The quality of total RNA extracted by the modified hot borate method is the best, while the improvement in this method is more suitable for the extraction of total RNA of different periods of the same species and different varieties of cotton fiber of the same period. [ Conclusion ] Comparison of cotton fiber total RNA extraction methods, the total RNA extracted by comparing three kinds of cotton fiber, quality of total RNA extracted by the modified hot borate method is the best, and improvement of it could better meet the transcriptome expression profiling sequencing requirements.

【期刊名称】《农业科学》 【年(卷),期】2012(049)009 【总页数】6页(P1594-1599)

【关键词】棉纤维;总RNA;表达谱;热硼酸法 【作 者】马顺尧;曲延英;高文伟;陈磊;郑炜佳;陈全家

【作者单位】农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052;农业大学农学院,乌鲁木齐830052;农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐830052 【正文语种】中 文

【中图分类】S562;S503.52

【研究意义】棉纤维的品质直接影响着我国棉纺织产品的档次，而棉纤维属于多糖多酚的植物组织，提取高质量的棉纤维总RNA为后续开展其转录组和表达谱测序提供必要条件，从而为改良纤维品质打下一定的基础。【前人研究进展】目前国内外开展的棉纤维总RNA提取的方法比较多［1～6］。【本研究切入点】这些棉纤维总RNA提取的方法能够用于转录组和表达谱测序还比较少。因此在提取其总RNA的过程中要防止多糖多酚以及其他次生产物对总RNA的影响，通过对热硼

酸法的改良可以很好的将总RNA与其他杂质分离。【拟解决的关键问题】通过筛选并改良适合满足转录组和表达谱测序的不同时期和不同品种提取棉纤维总RNA的方法，为以后更好的改良棉纤维品质提供理论依据。 1.1 材料

所用材料为新海21号和新陆中36号不同时期棉纤维，于2010年7～8月在农一师农科所试验田采集不同时间段的棉纤维，速冻于液氮中并保存至实验室后移到-80℃的冰箱保存。

1.2 所用试剂配制及耗材处理

RNA提取缓冲液：十水硼酸钠(200 mmol/L），EGTA(mmol/L），SDS(1%），DTT(10 mmol/L），脱氧胆酸钠(1%），PVP-40(2%），NP-40(0.7%）。20 mg/mL蛋白酶K(-20℃）；1.6 M的KCl；2和4 M的LiCl；10 mM的Tris-Cl(pH 7.5）；2 M的KAc(pH 5.5）；75%乙醇；以上试剂均用灭过菌的DEPC水配置。提取RNA所用的耗材都在DEPC水中浸泡24 h以上并高温灭菌后方可使用。氯仿，异丙醇。 1.3 方法 1.3.1 热硼酸法

称取0.2 g棉纤维组织加液氮研磨至粉末状，装入2 mL的离心管中，做好标记；向离心管中加入1 m L预热至65℃的RNA提取液于匀浆器上匀浆2～4 min；向离心管中加入30μL 20 mg/mL的蛋白酶K，震荡后在恒温摇床中40～45℃以350～450 r/min的转速30～50 min；加入100μL的1.6 mol/L的KCl，冰浴1 h；4℃12 000 g离心20 min，取上清；加入等体积的4 mol/L的LiCl，冰浴4～5 h；4℃12 000 g离心5 min，保留沉淀；用0.5 mL，2 mol/L的LiCl洗涤沉淀2～3次，每次洗涤将其混匀后12 000 g离心5 min；向沉淀中加入0.2 mL，10 mmol/L的Tris-Cl(pH 7.5），摇匀后4℃，12 000 g离心10 min，取上清；

加入40μL，2 mol/L的KAc(pH 5.5），冰浴10 min；4℃，12 000 g离心10 min，取上清；加入1 mL无水乙醇，-20℃，2～3 h；4℃，12 000 g离心10 min，弃上清；用冷却75%的乙醇洗涤沉淀2～3次；用30～50μL的DEPC处理过的H2O溶解沉淀，取1μL测量浓度及纯度，其余-80℃保存。 1.3.2 Trizol法

称取0.15 g棉纤维组织液氮研磨至粉末状装入2 mL的离心管中，迅速加入1.5 mL的Trizol，使用匀浆器匀浆2～3 min；将匀浆后的样品在室温下放置5 min以使核酸蛋白复合物完全分离；4℃，12 000 g离心10 min，取上清；加入0.3 mL氯仿，剧烈震荡20 s，室温放置3 min；4℃，12 000 r/min离心10～15 min，样品分为三层，取上层水相转移至新的离心管中；向水相中加入等体积的异丙醇，混匀室温放置20～30 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清；加入1 m L 75%的乙醇洗涤沉淀2～3次；4℃，5 000 r/ min离心3 min，倒出液体，注意不要到处沉淀，剩余少量液体用头吸出；室温放置晾干，根据需要加入30～100μL的DEPC处理过的H2O溶解沉淀，取出1μL检测浓度及纯度。 1.3.3 离心柱式

采用的是天泽基因天净沙系列试剂盒，具体步骤如下：称取0.2 g棉纤维样品，液氮研磨至粉末状；用药勺将研好的粉末状的棉纤维装进2 m L的离心管中，加入溶液A，并混匀；在离心管中加入0.3 m L的溶液B和0.2 mL自备氯仿，在振荡器上振荡30～50 s混匀，此时溶液呈现均匀的乳浊状；室温12 000 r/min离心5 min两相之间将有细胞破碎物；将上清液转移到另一干净的2 mL离心管中下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂物，避免触及或吸取，最好留下100μL的上清液不取；加入等体积的C液，充分颠倒混匀(此步要慢慢操作）；将一半的溶液转移到离心吸附柱(60911 B）中，12 000 r/min室温离心0.5 min，弃穿透液，将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中12 000 r/min室温离心

0.5min，弃穿透液；加0.7 mL通用洗柱液，室温离心0.5 min，弃穿透液；加0.3 m L通用洗柱液，室温离心0.5 min，弃穿透液；室温离心0.5 min，此步非常重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用；将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中(即1.5 m L的RNase-free离心管），加入50～100μL的RNA洗脱液，室温放置1～2 min；12 000 r/min室温离心0.5 min，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。 2.1 三种方法提取RNA的比较

RNA的纯度、浓度、完整性等直接体现了所提取的RNA的质量的高低。RNA的成分是28 S RNA、18 S RNA以及5 S RNA，根据琼脂糖凝胶电泳图上的条带可以在一定程度上判断总RNA的完整性，有无降解及有无DNA污染。同时通过NANODROP1000可以检测总RNA的纯度、浓度以及有无降解。通过这两种检测的结果就可以基本判断提取的棉纤维总RNA的质量。

实验采用的是三种方法来提取棉纤维不同时期的总RNA，改良的热硼酸法提取的棉纤维总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。图1

Trizol法提取的棉纤维总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。图2

天泽基因天净沙系列试剂盒提取的棉纤维的总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。图3 从非变性琼脂糖凝胶电泳的结果看，只有改良后的热硼酸法没有出现DNA残留污染，几乎没有出现降解的现象，棉纤维的总RNA出现了三条带，28S RNA、18S RNA以及比较少量的5S RNA条带。而在Trizol法以及天净沙系列试剂盒这两种方法虽然也出现了三条RNA条带，但是都出现了DNA条带的污染，并且RNA出现了较为明显的降解，其完整性已被破坏。

从NANODROP1000检测的结果看，同样是经过改良的热硼酸法提取的棉纤维总NRA的浓度、纯度都比较好，其中OD260/OD230的值都在2.0以上，说明蛋白质等杂质去除的比较干净，而其他的两种方法则效果比较差。试验中发现蛋白酶K

的用量在一定程度上增加时，特别是在棉纤维发育的5～15 d的时段，有利于提高RNA的收率，而NP-40的去除会对总RNA质量有略微影响，这与武耀廷等［7］的研究结果有所不同，具体的原因需要进一步试验验证。实验所提取的棉纤维的总RNA是用于做转录组以及表达谱的，热硼酸法经过多次改良，最终通过送到华大基因做转录组表达谱测序检测，这种方法提取的棉纤维总RNA完全符合做表达谱以及转录组的标准，且后续试验已经全部结束。表1 2.2 不同时期的棉纤维总RNA提取的比较(热硼酸法)

在实验中材料是采集的海岛棉新海21号和陆地棉新陆中36号的不同时间点的棉纤维，由于在海岛棉和陆地棉的棉纤维的发育过程中纤维细胞内的含糖量、含酚量、纤维素含量和蛋白质的含量在随着纤维细胞的分化、发育等时段的不同而发生变化。试验在分别对开花0、5、10、15、20和25 d的胚珠以及棉纤维总RNA进行提取时发现了一些规律，其中0和5 d的组织再加入提取液之后溶液的粘度很大，可能需要多一点提取液并重复离心。在提取0和5 d的组织总RNA的时候发现，需要将提取缓冲液中SDS的比例提高5%～10%，这样可以得到更好的结果，这可能在这两个时间段时组织中蛋白质的相对含量比较高，同时也可将蛋白酶K的用量提高10%～20%，可以降低蛋白质对RNA的影响；在10、15、20 d这三个时段的棉纤维组织的多糖相对含量比较高，需将KCl的含量提高5%～10%，更为有效的除去多糖对RNA的影响；在用LiCl沉淀以及对其进行清洗时，需要对含糖量高的时段的RNA多清洗1～2次，以达到更好的试验效果。 2.3 海岛棉和陆地棉棉纤维总RNA提取的差异(热硼酸法)

海岛棉和陆地棉的棉纤维品质相差比较大，尤其是在纤维的长度、比强度等方面表现的更为突出。这是受海岛棉和陆地棉纤维细胞发育过程中可溶性蛋白质的含量变化趋势、可溶性多糖含量的变化趋势等的不同影响的。相同的时间点，两种纤维的蛋白质含量和多糖含量是有区别的，因此要想提取出某个时间点的这两种棉纤维组

织的高质量的总RNA，就需要对热硼酸法进行适当的调整。在提取15和20 d这两个时间的棉纤维组织的总RNA过程中，需要将用于海岛棉纤维组织的KCl的量比用于陆地棉的量高出10%～15%，会得到跟好的效果，这可能是在此时间段的海岛棉纤维可溶性糖的含量高于此时的陆地棉纤维中的含量。在对0 d的胚珠进行总RNA的提取时，用于海岛棉的SDS以及蛋白酶K的量要比用与陆地棉的量高出5%和10%左右，可以达到更好效果，而在提取25 d这个时间的棉纤维总RNA时，用于陆地棉的SDS以及蛋白酶K的量要比用与海岛棉的量高出10%左右，可以得到很好的提取结果。

棉纤维组织为多酚、多糖、多次生物以及蛋白质含量较高的植物组织，细胞破碎后极易被氧化成红褐色物质，与核酸不可逆地结合［8］，在热硼酸法提取棉纤维总RNA的过程中加入的硼酸抑制酚类与RNA结合；DTT防止酚类物质的氧化［9］，PVP可以与酚类结合成复合物［10］，从而将大部分酚类物质除干净。通过蛋白酶K以及SDS的加入可将大部分的蛋白质消除掉，在加入蛋白酶K的同时加入KCl，可将多糖沉淀，最后通过浓度不同的LiCl来沉淀并清洗RNA，可将剩余的极少部分的酚类、糖类、蛋白质等杂质去除，进而得到纯度很高的总RNA。Trizol试剂中含有强氧化剂苯酚，能将纤维组织中的多酚类物质氧化，从而发生褐化效应导致在苯酚、氯仿抽提时的丢失［11］。而多糖会形成难溶的胶状物导致与RNA共沉淀［12］，如得不到及时的去除，将会导致RNA的丢失。天静沙系列的试剂盒由于不能同时具备这些物质以及相应的含量，所以在提取的棉纤维总RNA的纯度、产量、完整性都不如经过改良的热硼酸法提取的效果好。

棉纤维组织属于多糖多酚类的组织，尤其在纤维生长初期其他的影响因素会更多，如蛋白质含量比较高、次生物质较多等。因此提取棉纤维的总RNA的过程中要注意如下问题：

3.1 在实验的过程中要严格控制的环境，所有操作人员必须要佩戴一次性的手套以

及口罩，整个过程除了样品的研磨以及离心等步骤，尽量都在超净工作台内进行，超净台在使用前要用紫外灯消毒20～30 min。所有配置的试剂都要使用DEPC灭菌后的水进行配置。整个配置过程都在超净台内进行，以减少RNase的污染，由于棉纤维比较难研磨，所以在研磨之前要在液氮内冷冻0.5 h，之后用液氮快速研磨使其变成白色的粉末，快速进行下一步骤。

3.2 由于棉纤维组织的特性，因此要很好掌握每一种试剂的用量以及步骤，尽量将多糖、多酚、多次生物以及蛋白质等干扰因子的影响降到最低。

不同植物组织的组成差别很大，提取其总RNA的方法不尽相同，即使是同一植物不同组织的组成差别也是很大的，相同组织不同时期的组成成分的差别有时也比较明显［13］。因此针对棉纤维这种多糖多酚的植物组织需要选择能够很好的排除这些物质对棉纤维总RNA的方法，才可以很好的进行转录组和表达谱测序研究工作。

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