金雀异黄素协同雷公藤多苷干预去卵巢大鼠CIA的机制研究

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文章编号:2095-6894(2017)01-35-04

•基础与转化医学•

金雀异黄素协同雷公藤多苷干预去卵巢大鼠CIA的机制研究

李丹1，艾浩

2’3,李晓明3’4 c锦州市妇婴医院产科,2锦州医科大学附属第一医院妇产科,3辽宁省卵泡发育与生殖健

康重点实验室,4锦州医科大学组织胚胎学教研室，辽宁锦州121001)

Research on mechanisms of genistein com­bined with triptergium glycosides intervention lined witl

on collagen induced arthritis (CIA) of ovari- glycosides group rats was significantly reduced, with a statistically significant difference (P<0.01). CONCLUSION： Estrogen defi­ciency can induce the occurrence of CIA and aggravate the patho­logical degree of CIA. Supplement of plant estrogen can signifi­U Danectomized rats

1, 1 Department A1 Hao2^ , of Obstetrics, U Xiao-Mingi Women A

and Infants^ Hospital of Jinzhou, 2The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Univer­sity, 3 Liaoning Key Laboratory of Follicular Development and Reproductive Health, 4Department of Histology and Embryology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China

[Abstract] AIM: Rheumatoid arthritis to superposition of ovari-

ectomized rats with collagen induced II ( collagen induced arthri­

tis, CIA) were selected as experimental materials, and the syner­gistic effect and preliminary pharmacological mechanism of tripterygium glycosides and genistein were observed，to provide theoretical support and experimental evidence for treatment of postmenopausal women with rheumatoid arthritis. METHODS ： The rats were ovariectomized using general surgery method. The animal model of rheumatoid arthritis ( CIA) was prepared using the method of secondary immune response of bovine type II colla­gen. The effect of genistein combined mth tripterygium glycosides for the treatment of estrogen deficiency type CIA was observed, at the same time, the effect was compared with positive drug metho­trexate, the RESULTS curative effect of the combination of drugs was also evaluated. ： Compared with the model group, genistein combined with tripterygium glycosides group could better improve joint swelling and activity of ovariectomized CIA rats, and rat arthritis index and swelling degree were significantly decreased, the pathological degree of joint tissue was also obviously improved. The TNF-alpha and IL-6 level in the serum of rats of genistein combined with tripterygium glycosides group were significandy decreased, with statistically significant differences ( P<0.05), and the level of IL-10 was significantly increased, with a statisti­cally significant difference (P<0.05) ； The number or the ratio of peripheral blood CD4+T cell in genistein combined with triptetygiuni

收稿日期：2016-10-16;接受日期:2016-11 -02

基金项目：辽宁省高等学校优秀人才支持项目（LJQ2013092)作者简介:李丹

.硕士，主治医师.研究方向:妇科生殖内分泌.

E-mail *76936074® qq.com

通讯作者:李晓明.E-mail:Hxiaoming68327@ 163.com

cantly improve the effectiveness of the existing anti-RA. 【Keywords】 Genistein; tripterygium glycosides； ovariectomized

rats； rheumatoid arthritis

【摘要】目的:以去卵巢大鼠叠加n型胶原诱导的类风湿关 节炎(collagen-induced arthritis,

CIA)为实验材料，观察金雀异

黄素协同雷公藤多苷的疗效及初步药理机制,为针对绝经后 女性类风湿关节炎的治疗提供理论支持及实验证据.方法:采 用通用的手术法摘除大鼠卵巢，采用牛n型胶原二次免疫的 方法制备类风湿关节炎动物模型（CIA),观察金雀异黄素协 同雷公藤多苷治疗雌激素低下型CIA的影响，同时与阳性药 甲氨喋呤比较，评价该组合药物的药效.结果:与模型组比较, 金雀异黄素协同雷公藤多苷组能较好地改善去卵巢CIA大鼠 的关节肿胀及活动能力,大鼠关节炎指数及关节肿胀度均显 著下降，关节组织病理程度得到明显改善.金雀异黄素协同雷 公藤多苷组大鼠血清中TNF-a及

IL-6水平显著降低（P<

0.05),而IL-10水平呈显著升高趋势，差异有统计学意义(P< 0.05);金雀异黄素协同雷公藤多苷组大鼠外周血CD4+T细胞 数量/比例显著减少(P<0.01).结论:雌激素低下状态可诱导 CIA的发生并加剧CIA的病理程度.补充植物雌激素可显著 提高现有抗RA的药效.【关键词】金雀异黄素;雷公藤多香;去卵巢大鼠;类风湿关节炎 【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A

0引言

类风湿关节炎

（rheumatoid arthritis，RA )是一'种

以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾 病[*]，绝经期后女性RA发病率明显增高[® ,但临床 缺乏有效控制绝经期后女性RA病情发展的治疗方 案[3].金雀异黄素通过免疫调节作用可显著改善胶 原CIA)诱导的类风湿关节炎（

collagen-induced arthritis,

大鼠的关节病理状态，有望成为改善自身免疫

性疾病的补充用药[4].本研究以去卵巢大鼠叠加n

型胶原诱导的类风湿关节炎为实验材料，旨在探讨金 雀异黄素协同雷公藤多苷的疗效及初步药理机制，为

绝经后女性类风湿关节炎的治疗提供可借鉴思路.

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材料和方法

1.1试剂及仪器金雀异黄素购自西安冠宇生物技 术有限公司（含量多98%),雷公藤多苷购自江苏美 通制药有限公司（Z32021007)，甲氨喋呤购自上海医 药(集团）有限公司信宜制药总厂，牛H型胶原、不完 全弗氏佐剂、anti-collagen II—抗均购自Chondrex公 司（美国），大鼠TNF-ct及大鼠IL-6、IL-10酶联免疫 试剂盒购自Bender公司（美国）；大鼠皮质酮酶联免 疫试剂盒（EIA-4164)购自德国DRG公司（批号: 61k059) ,PE-anti-Rat CD3 (Clone G4.18) ,FITC-anti- 转化医学电志

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1

上用450 nm波长测0D值、计算anti-collagen II、 TNF-a、IL-6 及 IL-10 水平.

1.3,4大鼠外周血CD4+及CD8+细胞亚型分析大 鼠外周血CD4+及CD8+亚型分析采用流式细胞术，样 品制备方法如下.大鼠麻醉后经腹主动脉采血(抗凝 处理），收集lxlOVmL细胞至3个1.5 mL EP管中， 每管1 mL;用PBS洗液洗3次，重悬细胞至100 jjlL PBS洗液中；管中分别加人FITC-CD3和PE-CD4, FITC-CD3和PEcy5-CD8,以及同型对照抗体，4T避 光觯育30 min;用PBS洗液洗3次，弃上清，细胞用 Rat CD4 (Clone 0X35)及 FITC-anti-Rat CD8 (Clone 0X8)流式细胞术用荧光抗体为eBioscience公司产 品.T10 BASIC手持式分散机(德国IKA)，Leica-Qwin 图像分析系统（德国Leica公司），K15离心机（德国 Sigma) ’OLYMPUS AU640型全自动生化分析仪（日 本OLYMPUS公司），Beckman Gallios型流式细胞仪 (美国Beckman公司）.

1.2实验动物健康雌性SD大鼠，体质量（150±

10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动 物饲养证号:SCKK-2005-0004.清洁级动物室适应性 喂养1周后进行分组和处理.普通饲料正常饲喂、自 由饮水.

1.3实验方法

1.3.1去卵巢叠加CIA大鼠模型制备及评价参照 文献方法手术摘除双侧卵巢，切除手术第28天，制 备大鼠CIA模型[6]:牛I型胶原（2 g/L)与等容积不 完全弗氏佐剂混合、乳化处理(终浓度1 g/L)，以0.2 ml/只（200 pg)于大鼠尾根部皮下注射，初次免疫大 鼠.7 d后以0.1 mL/只（100 |xg)于大鼠尾根行加强 免疫.每隔一天测量关节炎指数和足趾肿胀度，评估 CIA形成情况.参照5级评分法计算关节炎指数[7]. 关节肿胀度测量法[8]，采用足趾容积测量仪测量踝 关节的容积，计算关节肿胀度.

1.3.2实验动物分组及给药方法实验动物随机分 为四组，即假手术组10)、去卵巢CIA组（简称模 型组，《= 10)、甲氨喋呤治疗组（阳性药物对照， n= 10)及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组（《= 10). 治疗组动物于加强免疫之日起开始灌胃，给予甲氨喋 呤(2.7 mg/kg体质量）、雷公藤多苷（70 mg/kg体质 量）和金雀异黄素（30 mg/kg体质量）进行干预 (1次/d),连续干预3周.假手术组及模型组大鼠灌 胃给予等量的蒸馏水.

1.3.3 大鼠血清中TNF-ot、IL-6及IL-10水平检测 依照ELISA试剂盒说明书的步骤操作，对大鼠血清 中TNF-a、IL-6及IL-10的水平进行测定，在酶标仪

500 uL含1%多聚甲醛的PBS重悬，置4T避光保存 待测.

1.3.5关节组织病理学检测大鼠踝关节经10%福 尔马林固定7 d后，采用福尔马林/硝酸脱钙液(Clay- den 氏液) 脱钙、常规石蜡包埋, HE 染色.依据通用病 理评分标准对关节病理损伤做半定量分析.

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计学软件对数

据进行处理，数据采用单因素方差分析（one-Way AN0VA)和LSD检验作组间比较，计量资料用表 示，组间比较用f检验，P<〇.〇5表示差异具有统计学 意义.

2

结果

2.1行为学观察结果行为学观察结果提示，去卵 巢大鼠可被诱发较严重的关节炎病理改变.甲氨喋 呤治疗组和金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠 关节红肿状态明显减轻,活动相对增多.与甲氨喋呤 治疗组比较，金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠 体毛光泽度好，肛周污秽物显著减少,表明补充植物

雌激素能较好地改善雌激素低下型CIA的病理过程. 2.2各组大鼠关节肿胀度和关节炎评分结果比较 与假手术组比较，模型组大鼠关节肿胀度及关节炎评 分均显著增高，差异有统计学意义(P<0.01).与模型 组比较，甲氨喋呤及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗 组大鼠关节肿胀度及关节炎评分均显著降低,差异有 统计学意义(P<〇.〇5,表1).

表

1

各组大鼠关节肿胀度和关节炎评分结果比较

(n= 10, ^±5)

组别

关节肿胀度

（％)

关节炎评分

假手术组

15.20±5‘800.10±0.05模型组

60.50±17.40b2.38±0.48b甲氨喋呤治疗组

49.60±23.20d2.00 土 0.33a金雀异黄素协同雷公藤多苷组

47.80±20.80d

1.95±0.37d

b/^O.Ol

假手术组

;aP<0.05 似模型组；

SpcO.Ol财模型组

.

转化医学电子杂志（

E，J Transl Med)2017,4(l)

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喋呤及金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠外周 血CD4+和CD8+T细胞数量均显著减少，差异有统计 学意义(P<0.05,表4、图1).

表

2.3关节组织病理学检测结果正常大鼠踝关节

腔、关节软骨及滑膜组织结构完整、清晰.去卵巢CIA 大鼠膝、踝关节可见明显的滑膜细胞增生，排列紊乱， 滑膜组织充血水肿，毛细血管增生，并可见炎细胞浸 润，增生的滑膜组织形成绒毛状，可伸向关节腔深处， 或向软骨面爬行形成血管翳.

2.4各组大鼠血清中

4

各组大鼠外周血中

T细胞亚群检测结果比较

(w = 10，无±s)

TNF-a水平检测结果与假

组别假手术组模型组

手术组比较，模型组大鼠血清中TNF-a水平显著升 髙，差异有统计学意义（户<〇.〇1);与模型组比较，甲 CD4+

21.91±3.2436.10±5.128CD8+3.05±1.274.76±2.15氨喋呤和金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大鼠血 清中TNF-a水平显著降低，差异有统计学意义（ 0.05或 P<0.01，表 2).

表

2

各组大鼠血清中

TNF-cX水平检测结果比较

(Al= 10, X±s)

组别TNF-a(ng/mL)假手术组 19.50±2.84模型组

47_90±9_81b甲氨喋呤治疗组

41.10±9.32a金雀异黄素协同雷公藤多苷组

36.70±7.76d

bP<0.01 w 假手术组；aP<0.05 w模型组；dP<0.01仍模型组.

2.5各组大鼠血清中

IL-6和IL-10水平检测结果比

较与假手术组比较，模型组大鼠模型血清中IL-6 和IL-10的水平均显著增髙，差异有统计学意义（P<

〇.〇1

)，与模型组比较，甲氨喋呤治疗组IL-6和IL-10

水平显著下降，金雀异黄素协同雷公藤多苷治疗组大 鼠血清中IL-6水平显著下降，而IL-10水平显著增 髙，差异有统计学意义(P<〇.〇5，表3)

.

表

3

各组大鼠血清

IL-6及IL-10水平检测结果比较

(71= 10，无±5)

组别IL-6 IL-10假手术组 40.21±5.74

21.04±3.27 模型组

68.37±5.99b 54.38±10.15b 甲氨喋呤治疗组

52.16±7.99a 46.76±5.39a 金雀异黄素协同雷公藤多苷组

47.77±6.18a

71.36±7.99d

hP <0.05 仍假手术组；0T<0.05 i;s模型组；dP<0.01仍模型组.

2.6各组大鼠外周血

CD4+、CD8+亚型检测结果比

较与假手术组比较，模型组大鼠血清中CD4+T细 胞数量显著增多，差异有统计学意义（P<〇.〇5)，而 CD8+T细胞数量没有明显改变.与模型组比较，甲氨

甲氨喋呤治疗组

26.10±3.73°1.65±0.396金雀异黄素协同雷公藤多苷组

24.10±2.57°1.06±0.99°

T<0.05 w假手术组;eP<0.05 w模型组.

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A-D: CD3/CD4双标记细胞;E-H: CD3/CD8双标记细胞

图2大鼠外周血CD4+、CD8+细胞亚型检测结果

3

讨论

RA发病多见于女性[9]，女性在绝经前发病率平

稳，口服避孕药或给予雌激素替代治疗对RA病情的 稳定有明显促进作用[1t

绝经后发病率明显升高，提

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示雌激素与RA发病之间可能存在关联fu_13].本研 究发现,去卵巢大鼠由于缺少雌激素的生理调节作 用，对n型胶原诱发的cia非常敏感.补充植物雌激 素(金雀异黄素）能显著提高临床常规抗类风湿药物 的疗效.雷公藤多苷与甲氨喋呤的药理机制类似[14]， 主要通过免疫调节、抗炎等发挥抗RA的作用.然而， 因其副反应及成分复杂、药理作用未彻底明了等因 素，临床上并未得到广泛应用.本研究将有植物雌激 素作用的天然异黄酮化合物金雀异黄素与雷公藤多 苷配伍使用，以期为临床雌激素低下型RA的治疗提 转化医学电志

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[3] van Vollenhoven RF, Houbiers JG, Buttgereit F, et al. The selec­

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综上所述，金雀异黄素协同雷公藤多苷对去卵巢 CIA具有较为肯定的疗效，在改善部分指标上优于甲 氨喋呤，表明补充植物雌激素可显著提高现有抗RA 的药效.其药理机制可能为:下调促炎性因子（TNF- a、IL-6)并上调抑制炎症细胞因子（IL-10)的水平，从 而发挥抗炎作用.此外，通过抑制CD4+T细胞的分 化，发挥免疫调节作用.

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