中国动物传染病学报２０１３，２１（６）：３３—３８ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ・研究论文・ 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶３在２９３Ｔ细胞中 的表达研究 王晔，韩红玉，董辉，姜连连，赵其平，朱顺海，薛璞，舒凡帆，黄兵 （中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室，上海２００２４１） 摘要：为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶３（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｃａｌｃｉｕｍ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ３，ＥｔＣＤＰＫ３）基因的重组质 粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３，并转染２９３Ｔ细胞进行表达，以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮＡ为模板，经ＰＣＲ扩增其含完整开放 阅读框的序列，将其克隆至ｐＧＥＭ．Ｔ ｅａｓｙ载体，构建ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３重组质粒，双酶切回收目的片段后与相应酶切的 真核表达载体ｐＣＡＧＧＳ连接，构建真核重组表达质粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染２９３Ｔ细 胞进行表达，分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定ＥｔＣＤＰＫ３基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒ｐＣＡＧＧＳ— ＥｔＣＤＰＫ３经过双酶切鉴定，可见１条大小约为１３０２ ｂｐ的目的条带，测序结果与实验室已获得的ＥｔＣＤＰＫ３序列完全一致； Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果可见大小约为４９ ｋＤａ的目的蛋白条带，间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构 建了ＥｔＣＤＰＫ３的真核重组表达质粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３，并在真核细胞中获得表达，为深入研究ＥｔＣＤＰＫ３的功能和制备ＤＮＡ 疫苗奠定了基础。 关键词：柔嫩艾美耳球虫；钙依赖蛋白激酶３基因；２９３Ｔ细胞；真核表达 中图分类号：￥８５２．７２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—６４２２（２０１３）０６—００３３—０６ ＣｏＮＳＴＲＵＣＴＩｏＮ ｏＦ ＲＥＣｏＭＢＩＮＡＮＴ ＰＬＡＳＭＩＤＳ ｏＦ Ｅ ｆ４ ＮＥＬＬＡ ＣＡＬＣＩＵＭ．ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ ＰＲｏＴＥＩＮ ＫＩＮＡＳＥＳ ３ ＧＥＮＥ ＡＮＤ ＩＴＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＩＮ ２９３Ｔ ＣＥＬＬＳ ＷＡＮＧ Ｙｅ，ＨＡＮ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＤＯＮＧ Ｈｕｉ，ＪＩＡＮＧ Ｌｉａｎ－ｌｉａｎ，ＺＨＡＯ Ｑｉ－ｐｉｎｇ，ＺＨＵ Ｓｈｕｎ—ｈａｉ，ＸＵＥ Ｐｕ， ＳＨＵ Ｆａｎ—ｆａｎ，ＨＵＡＮＧ Ｂｉｎｇ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＡｎｉｍａｌＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｅｔ：Ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ３（ＥｔＣＤＰＫ３）ｇｅｎｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥｔＣＤＰＫ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｆｕｌｌ・ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ＥｔＣＤＰＫ３ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｏｆ Ｅ ｔｅｎｅｌｌａ ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ ｏｏｃｙｓｔｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＭ．Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３．Ｔｈｅ ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３ ａｎｄ ｐＣＡＧＧＳ ｖｅｃｔｏｒ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３ ｗａｓ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒｉｐ ｏｆ ａｐｐ．１ ３０２ ｂｐ ｗａｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ＣＤＰＫ３ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｅｘａｃｔｌｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈａｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＥｔＣＤＰＫ３ ｐｒｏｔｅｉｎ 收稿日期： ２９１３—０９—１０ 基金项目： 级公益性科研院所基本科研业务费项目（２０１２ＪＢ １４） 作者简介： 王哗，男，硕士研究生，预防兽医学专业 通信作者： 黄兵，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｂｉｎｇ２３２＠１６３．ｃｏｍ 中国动物传染病学报 ２０１３年ｌ２月 ｗａｓ ｖｅｒｉｉｆｅｄ ｉｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＥｔＣＤＰＫ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｐｐ．４９ ｋＤａ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｎｉｉｄ ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３ ａｎｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＥｔＣＤＰＫ３ ｉｎ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏ１１ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ；ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ３：２９３Ｔ ｃｅｌｌ；ｅｒｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 钙依赖的蛋白激酶（ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ 限公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、性内切酶Ｓａｃ Ｉ ｋｉｎａｓｅ，ＣＤＰＫｓ），又称类似钙调素结构域的蛋白 激酶（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ），存 和Ｓｍａ Ｉ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物工程有 限公司；ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司； 在于植物、绿藻、纤毛虫及顶复器原虫中，且在植 物体内分布广泛，但是在细菌、真菌、线虫和脊椎 动物中尚未发现。Ｃａ２ 在动植物细胞的信号传导途 径中具有重要作用，Ｃａ２ 作为第二信使，通过 ＣＤＰＫｓ的活动来发挥功能，是其传递信号的主要途 径之一。ＣＤＰＫｓ在没有钙调蛋白和磷脂时可被Ｃａ２ 活化，参与Ｃａ２ 和磷酸化依赖信号途径的信号传导， 并在基因表达、代谢、离子转运、信号途径构成和 细胞骨架形成中起调节作用…。有研究表明顶复器 原虫的ＣＤＰＫｓ对虫体在宿主体内完成整个生活史起 着至关重要的作用瞄】。 真核表达载体ｐＣＡＧＧＳ被广泛应用于ＤＮＡ疫 苗的研制及ＲＮＡ病毒反向遗传操作等领域。本文 使用的表达载体为ｐＣＡＧＧＳ真核表达载体，具有 较高表达效率，目前世界范围内许多研究者都利 用它来进行相关研究 。该研究在本实验室前期研 究基础上 ，将柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶３ （Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３，ＥｔＣＤＰＫ３）基因克隆到改造后的真核表达质粒 ｐＣＡＧＧＳ中，并转染２９３Ｔ细胞进行蛋白表达，为进 一步研究ＥｔＣＤＰＫ３的生物学功能和研制球虫ＤＮＡ 疫苗奠定了基础。 １材料与方法 １．１材料柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊ｃＤＮＡ、兔源 性抗ｒＥｔＣＤＰＫ３多抗，由本课题组制备保存；真核 表达载体ｐＣＡＧＧＳ和真核细胞２９３Ｔ由中国农业 科学院上海兽医研究所猪病研究室童光志老师馈 赠；大肠杆菌ＴＯＰ１０、ＤＬ２０００（ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ）购 自天根生化科技（北京）有限公司；ＤＮＡ胶回收 试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；胎牛血清、 ＤＭＥＭ、ｏｐｔｉ—ＭＥＭ购自Ｇｉｂｃｏ公司；Ｗｅｓｔｅｒｎ及 ＩＰ细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司； 红色荧光标记山羊抗兔二抗购自Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司；近红外荧光羊抗兔ＩｇＧ购自ＬＩ—ＣＯＲ 公司。 １．２引物设计与合成以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊 ｃＤＮＡ为模板，根据实验室利用ＲＡＣＥ扩增获得的 全长ＥｔＣＤＰＫ３基因序列设计引物，扩增该基因完 整的ＯＲＦ序列，长度约１３０２ ｂｐ。引物由上海赛百 盛生物技术有限公司合成。上游引物序列：５＇－ＧＣ ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧ一３’，下游引 物序列：５＇－ＧＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡ ＴＴ一３’。上游引物引入Ｓａｃ Ｉ酶切位点，下游引物引 入Ｓｍａ Ｉ酶切位点。ＰＣＲ反应总体积２０ Ｌ，其 中模板２ Ｌ、上下游引物各０．５ Ｌ、ｒＴａｑ ＤＮＡ聚 合酶ｌ Ｌ、ｄＮＴＰｓ ２ Ｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ Ｌ， 灭菌ｄｄＨ Ｏ补至２０ Ｌ。反应条件：９４ｏＣ预变性２ ｍｉｎ；９４℃变陛３０ Ｓ，５０℃退火４０ Ｓ，７２ｏＣ延伸９０ Ｓ， ３０个循环；最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。用１％琼脂糖凝 胶电泳检测ＰＣＲ产物，切胶回收目的片段。将纯化 的目的片段经连接酶与ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ载体连接，连 接产物转化至大肠杆菌感受态细胞ＴＯＰ１ ０中，培养 过夜后挑取白色单菌落培养，ＰＣＲ鉴定后提取质粒， 进行双酶切鉴定并测序。 １．３构建ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３真核表达质粒利用限 制性内切酶Ｓａｃ Ｉ和Ｓｍａ １分别对鉴定正确的重组 质粒ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３和ｐＣＡＧＧＳ空载体进 行双酶切，酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳，用胶 回收纯化试剂盒分别回收目的片段，１６℃连接过夜 第２ｌ卷第６期 王哗等：柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶３在２９３Ｔ细胞中的表达研究 后转入大肠杆菌感受态细胞ＴＯＰ１０中，涂板培养过 夜，挑取单菌落于４ ｍＬ ＬＢ培养基中培养１２ ｈ后， 进行ＰＣＲ鉴定，对鉴定为阳性的菌液提取质粒进行 双酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒命名为ｐＣＡＧＧＳ— ＥｔＣＤＰＫ３。 稀释的红色荧光标记的山羊抗兔二抗，３７℃作用 ｌ ｈ；再用ＰＢＳＴ洗涤６次，加入ＰＢＳＴ ｌ ｍＬ。荧光 显微镜下观察，并拍照保存。 １．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定ｐＣＡＧＧＳ．ＥｔＣＤＰＫ３的表达 情况收集步骤１．４中培养４８ ｈ的２９３Ｔ细胞，加入 Ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ细胞裂解液１００ Ｌ，４℃、１３ ０００ ｘｇ 离心３ ｍｉｎ，取上清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳。半干法 １．４ ２９３Ｔ细胞的复苏培养用含５％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养２９３Ｔ细胞。转染前，收集２９３Ｔ细胞 进行细胞计数，以每孔５×１０ 个细胞接种６孔板２ 块，３７℃，５％ＣＯ２培养过夜，按照ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＭ Ｔ２０００脂质体转染操作步骤分别将ｐＣＡＧＧＳ空载体和 重组质粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３转染２９３Ｔ细胞，置于 ３７ｏＣ、电转移至ＰＶＤＦ膜上，５％脱脂奶粉封闭过夜；ＰＢＳ 洗涤３次，加入１：１００稀释的兔抗ｒＥｔＣＤＰＫ３蛋白多 抗血清，３７℃孵育２ ｈ；ＰＢＳ洗膜３次，加入１：１０ ０００ 稀释的近红外荧光羊抗兔ＩｇＧ，３７ｏＣ孵育２ ｈ，ＰＢＳＴ ５％ＣＯ。培养４ ｈ，更换含有２％胎牛血清的 洗膜１次，ＰＢＳ洗膜３次，用Ｏｄｙｓｓｅｙ双色红外激 光成像系统进行拍照。 ｏｐｔｉ—ＭＥＭ培养基。培养４８ ｈ后，取其中ｌ块６孔 板进行间接免疫荧光，收集另一块６孔板的２９３Ｔ细 胞用于Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测。 １．５间接免疫荧光（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ，ＩＦＡ）鉴定ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３的表达情况 ２结果 ２．１ ＥｔＣＤＰＫ３基因的克隆以柔嫩艾美耳球虫孢子化 卵囊ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出１条大约１３０２ ｂｐ 在培养４８ ｈ后，取步骤１．４中转染后的２９３Ｔ细胞， 用２％多聚甲醛ｌ ｍＬ固定１５ ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗涤３次， 加入ｌ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００ ｌ ｍＬ，室温下作用１５ ｍｉｎ； 用ＰＢＳＴ洗３次，加入２％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２ ｍＬ，４￣Ｃ封闭 的目的条带；将其与ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ载体连接，转化 大肠杆菌感受态细胞ＴＯＰ１０后，菌液经ＰＣＲ鉴定 出现与预期大小一致的片段（图１Ａ）、质粒经双酶 切鉴定，可见２条带，其大小也与预期目的条带一 致（图１Ｂ）。测序结果与预期序列完全一致，表明 ＥｔＣＤＰＫ３基因正确插入ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ载体。 过夜；ＰＢＳＴ洗涤３次，加入兔抗ｒＥｔＣＤＰＫ３蛋白的 多抗，３７℃作用ｌ ｈ；ＰＢＳＴ洗涤３次，加入１：５００ ２０００ １０００ ７５０ ５００ ２５０ １００ ２０００ １０００ ７５０ ５００ ２５０ ｌ００ Ａ Ｂ 图１ ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３的ＰＣＲ及其双酶切鉴定结果 Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３ Ｍ：ＤＮＡ分子量标准（ＤＬ２０００）；１：阴性对照；２：ＥｔＣＤＰＫ３基因ＰＣＲ鉴定结果；３：ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３双酶切结果 Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ｆＤＬ２０００）；１：Ｎｅｇ￣ｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２：ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆＥｔＣＤＰＫ３ ｇｅｎｅ；３：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＧＥＭ－ Ｔｅａｓｙ－ＥｔＣＤＰＫ３ 第２ｌ卷第６期 王哗等：柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶３在２９３Ｔ细胞中的表达研究 ２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３在２９３Ｔ 粒的２９３Ｔ细胞中，未检测到相应的目的条带（图４）。 表明ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３重组质粒在２９３Ｔ细胞中表 达。 细胞中的表达Ｗｅｓｔｅｎ ｒｂｌｏｔ结果显示，在转染重组 质粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３的２９３Ｔ细胞中，可以检测 到大小为４９ ｋＤａ的蛋白质条带；而在转染空载体质 １７０ １３０ ９５ ５５ ４３ ４９ ３４ ２６ ｌ７ 图４ ＥｔＣＤＰＫ３重组蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果 Ｆｉｇ．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥｔＣＤＰＫ３ Ｍ：预染的蛋白质标准分子量；１：转染ｐＣＡＧＧＳ载体的２９３Ｔ细胞：２：转染ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３的２９３Ｔ细胞 Ｍ：Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｔｈｅ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＣＡＧＧＳ ｖｅｃｔｏｒ；２：Ｔｈｅ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３ ３讨论 最近一些研究表明在恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）和刚地弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ） 嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫（巨ｍａｘｉｍａ）中获 得了ＣＤＰＫ１，研究发现ＣＤＰＫ１在球虫入侵宿主细 胞时起着关键作用。国内也有ＣＤＰＫ基因的相关研 究，周建民等Ⅱ剐用ＥｔＣＤＰＫ重组蛋白免疫鸡获得了 一中，ＣＤＰＫｓ参与虫体入侵与逃逸宿主细胞的过程。 Ｌｏｕｒｉｄｏ等 证实ＴｇＣＤＰＫ１是钙离子信号传导途径 下游的重要传感器，控制着微线体的胞外分泌，敲 除ＴｇＣＤＰＫ１后可阻断微线体的分泌，从而破坏虫 体的滑行运动、入侵及逃逸。另外，研究发现恶性 疟原虫的ｐＦＣＤＰＫ１参与红内期感染阶段虫体的入 侵及逃逸瞄 】。伯氏疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ） ＰｂＣＤＰＫ３基因缺失可使动合子感染蚊子中肠的能力 减弱，表明ＰｂＣＤＰＫ３着动合子的滑行运动和 定的免疫保护作用，说明ＣＤＰＫ可作为鸡球虫基 因工程疫苗的候选基因。孔春林等ｎ 在毕赤酵母细 胞中表达了具有活性的天然ＥｔＣＤＰＫ３蛋白，以期对 其功能作进一步研究。Ｈａｎ等ｎ剐对柔嫩艾美耳球虫 ＥｔＣＤＰＫ３基因进一步研究发现用抗ｒＥｔＣＤＰＫ３蛋白 特异性抗体与子孢子作用后，子孢子入侵细胞的能 力降低，表明ＥｔＣＤＰＫ３与球虫入侵宿主细胞相关。 由于ＣＤＰＫｓ只存在植物、绿藻、纤毛虫及顶复 器原虫，研究发现ＣＤＰＫｓ在顶复器原虫的细胞周期 侵入中肠上皮细胞的能力［６－８］ｏ疟原虫ＣＤＰＫ４与配 子形成有关 ，Ｐｔ￣ＤＰＫ５是虫体逸出红细胞所必不 可少的［１０１ ｏ ＰｂＣＤＰＫ６可与一些信号分子协同作用， 和生活史的进程中具有料想不到的功能，而且 在宿主脊椎动物体内没有发现ＣＤＰＫｓ，因此顶复器 使子孢子在肝脏感染早期入侵肝细胞 ”。鸡球虫 和弓形虫，疟原虫同属于顶复器原虫，都需要入侵 原虫（包括鸡球虫）的ＣＤＰＫｓ分子将来很可能作为 新治疗药物的靶标和研制新型疫苗的靶分子［１６］ｏ本 宿主细胞，在宿主细胞内生长繁殖，因此鸡球虫的 ＣＤＰＫｓ也可能有一些相似的功能。Ｄｕｎｎ等 从柔 文采用真核表达载体进行表达，与原核表达系统相 比，所表达的蛋白更接近于天然蛋白，有利于将来 ・ ３８ ・ 中国动物传染病学报 ２０１３年ｌ２月 对该蛋白的功能进行研究。ｐＣＡＧＧＳ载体为含有鸡 Ｂ—ａｃｔｉｎ启动子和ＣＭＶ增强子的高效真核表达载体， 在基因表达方面具有优势。姜永萍等 同时构建了 含有禽流感病毒ＨＡ基因的真核表达载体ｐＣＡＧＧＳ— ＨＡ５和ｐＣＩ—ＨＡ５，然后分别转染２９３Ｔ细胞进行短 暂表达，采用间接免疫荧光的方法检测ＨＡ蛋白的 表达，结果ｐＣＡＧＧＳ—ＨＡ５特异免疫荧光信号强度 显著高于ｐＣＩ—ＨＡ５。 本文通过对ＥｔＣＤＰＫ３基因完整开放阅读框序列 进行克隆，通过ＰＣＲ技术在基因序列上游和下游分 别引入Ｓａｃ Ｉ和Ｓｍａ Ｉ酶切位点，成功构建了重组 真核表达质粒ｐＣＡＧＧＳ－ＥｔＣＤＰＫ３，并转染到２９３Ｔ 细胞中，通过免疫印迹和间接免疫荧光的方法证实 ＥｔＣＤＰＫ３基因在真核细胞中成功表达，为进一步研 究该蛋白的生物学功能和研制球虫ＤＮＡ疫苗奠定了 基础。 参考文献 ［１］Ｌｏｕｒｉｄｏ Ｓ，Ｓｈｕｍａｎ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｌ ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６５（７２９６）：３５９－３６２． 【２］Ｇｒｅｅｎ Ｊ Ｌ，Ｒｅｅｓ－Ｃｈａｎｎｅｒ Ｒ Ｒ，Ｈｏｗｅｌｌ Ｓ Ａ，ｅｔ ａ１． Ｔｈｅ ｍｏｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ： ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ 『Ｊ】．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００８，２８３（４５）：３０９８０－３０９８９． 【３】姜永萍，张洪波，步志高，等．表达载体ｐＣＡＧＧＳ显著增 强禽流感ＤＮＡ疫苗的免疫保护效果［Ｊ】．中国农业科学， ２００６，３９（４）：８２５－８３０． 【４】李洋．柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究［Ｄ】．北京： 中国农业科学院，２０１０． ［５１ Ｋａｔｏ Ｎ，Ｓａｋａｔａ Ｔ，Ｂｒｅｔｏｎ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｌｉｎｋ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２００８，４（６）：３４７－３５６． ［６１ Ｂｉｌｌｋｅｒ Ｏ，Ｌｏｕｒｉｄｏ Ｓ，Ｓｉｂｌｅｙ Ｌ Ｄ．Ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ ｐａｒａｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２００９，５（６）：６１２—６２２． 【７】Ｓｉｄｅｎ－Ｋｉａｍｏｓ Ｉ，Ｅｃｋｅｒ Ａ，Ｎｙｂａｃｋ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｏｋｉｎｅｔｅ ｇｌｉｄｉｎｇ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｍｉｄｇｕｔ ｉｎｖａｓｉｏｎ【Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，６０（６）：１３５５－６３． ［８】Ｉｓｂｉｎｏ Ｔ，Ｏｒｉｔｏ Ｙ，Ｃｈｉｎｚｅｉ Ｙ，ｃｔ ａ１．Ａ ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｏｋｉｎｅｔｅ ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌ１．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，５９（４）： ｌｌ７５－８４． ［９】Ｂｉｌｌｋｅｒ Ｏ，Ｄｅｃｈａｍｐｓ Ｓ，Ｔｅｗａｒｉ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ａ ｃａｌｃｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇａｍｅｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ ［Ｊ】．Ｃｅｌｌ，２００４，１ ｌ７（４）：５０３—５１４． 【１０】Ｄｖｏｒｉｎ Ｊ Ｄ，Ｍａｒｔｙｎ Ｄ Ｃ，Ｐａｔｅｌ Ｓ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｌａｎｔ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｒａｓｉｔｅ ｅｇｒｅｓｓ ｆｒｏｍ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２８（５９８０）：９１０— ９ｌ２． ［】１］Ｃｏｐｐｉ Ａ，Ｔｅｗａｒｉ Ｒ，Ｂｉｓｈｏｐ Ｊ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｓｉｇｎａｌ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ ｔＯ ｓｔｏｐ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｖａｄｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２００７，２（５）：３１６－２７． 【１２１ Ｄｕｎｎ Ｐ Ｐ，Ｂｕｍｓｔｅａｄ Ｊ Ｍ，Ｔｏｍｌｅｙ Ｆ Ｍ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ——ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ａｎｄ Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ［Ｊ】． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９６，ｌ １３（ｐｔ５）：４３９—４４８． ［１３】周建民，鲍杰，汪明．柔嫩艾美耳球虫甘肃株钙调域蛋白 激酶基因的克隆与表达［Ｊ１．畜牧兽医学报，２００５，３６（７）： ７１ １－７１４． ［１４］孔春林，韩红玉，李洋，等．柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白 激酶３基因在毕赤酵母中的表达及分析［ＪＪ．生物技术通 报，２０１２，（４）：１０８一ｌｌ２． ［１５］Ｈａｎ Ｈ Ｙ，Ｚｈｕ Ｓ Ｈ，Ｊｉａｎｇ Ｌ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｌｃｉｕｍ— ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ［Ｊ】． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２０１３，１４０（６）：７４６—７５５． ［１６】李洋，韩红玉，黄兵．顶复器原虫钙依赖蛋白激酶的研究 进展［Ｊｌ＿热带医学杂志，２０１０，ｌ０（２）：２２３—２２５．
