041 结核分枝杆菌核酸扩增检测标准操作-检验科作业指导书

*****检验科 作业指导书 结核分枝杆菌核酸扩增 检测标准操作 文件编号： 版本： 生效日期： 页码： 第1页共2页 【预期用途】 适用于结核分枝杆菌(TB)感染的辅助诊断。本试剂盒仅限用于经卫生行政机构认可的医疗单位的实验室使用。 【检验原理】 用一对沙眼衣原体特异性引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，配以PCR 反应液、耐热DNA 聚合酶（Taq 酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR 体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。 【主要组成成分】 试剂名称 DNA 提取液 PCR 反应管（未贴标签管） 阴性质控品 TB临界阳性质控品 TB强阳性质控品 规格 （500μl/管） 1人份/管 250μl/管 50μl/管 50μl/管 组成成份 去污剂和Tris盐酸缓冲液 TB特异引物探针和%q酶 无菌生理盐水 TB减毒菌株稀释液 TB减毒菌株稀释液 数量 2管 20管 1管 1管 1管 用途 样本处理 样本处理 样本处理 样本处理 样本处理 【储存条件及有效期】保存于-20℃；有效期6 个月。 【所需设备】ABI PRISM 7000型核酸扩增荧光检测仪、台式高速冷冻离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯。 【样本要求】 用无菌5m1玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1～3 m1,密闭,即为标本。或直接抽取外周血2 m1 (抗凝)。标本可立即用于测试,也可保存于-20℃ 待测,保存期为6个月。标本运送应采用0℃ 冰壶。 【检验方法】 1.标本及质控品的处理 痰液中加入4倍体积的4%NIaOH,摇匀,室温下放置30分钟左右液化,取0.5m1至1.5m1离心管中,再加入0.5m14%№OH室温放置10分钟后15,000rpm离心5分钟。 去上清,沉淀加无菌生理盐水lm打匀,15,000rpm离心5分钟;再重复洗涤—次。(血液标本直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞)沉淀直接加50u1DNA提取液充分混匀,(提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象,可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。)沸水浴1O分钟(误差不超过1分钟),转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。10,000rpm离心5分钟,取上清液2u1做PCR反应。另取阴性质控品、阳性质控品各50u1加等量DNA提取液打匀,沸水浴10分钟后同上处理。 2．PCR 扩增 ABI Prism 7000 操作： 将各反应管放入PCR 仪器的孔反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件： 93℃预变性2 分钟，然后按93℃ 45 秒→55℃ 60 秒，先做10 个循环，最后按93℃ 30 秒→55℃ 45 秒，做30 个循环。 3．结果分析条件的设定： 反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline 的start 值（2～4），stop 值（7～9）以 *****检验科作业指导书

*****检验科 作业指导书 结核分枝杆菌核酸扩增 检测标准操作 文件编号： 版本： 生效日期： 页码： 第2页共2页 及Threshold 值，最后到Reporter 窗口下记录仪器自动分析计算出的Ct 值。 4. 质量控制 阴性质控品：全部阴性 阳性质控品：全部阳性 阴性质控品Ct值>临界阳性质控标准品Ct值>强阳性质控标准品Ct值，则本次实验有效。否则，实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。 【检验结果的解释】 阴性结果判定：如果Ct 值=30，则实验结果为阴性。 阳性结果判定：如果Ct值< 27，则实验结果为阳性。 试验灰度区：如果27≤Ct值< 30，则为试验灰度区，需重复试验一次，若重复试验结果Ct值<30判为阳性，否则判为阴性； 【注意事项】 1. 试验前请仔细阅读本说明书； 2. 试验室管理应严格按照PCR 基因扩增试验室的管理规范，试验人员必须进行专业培训，试验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，试验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用； 3. 为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，试验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器； 4. 对每次试验进行质量控制，应设置阳性对照、临界阳性对照和阴性对照； 5. 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 6. 试剂盒DNA 提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无 污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截； 7. 提取的DNA 可于-20℃保存6 个月； 8.“C”表示样品的浓度或含量； 9. 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 10.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。 11.本试剂盒内的阳性质控品和检测样品应视为具有传染性物质，因此标本操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。 编写：xxx 审核：xxx 批 准：xxx 批准日期：