一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107643351 A(43)申请公布日 2018.01.30

(21)申请号 201711060031.6(22)申请日 2017.11.01

(71)申请人 浙江科瑞医药科技有限公司

地址 321000 浙江省金华市东阳市江北街

道兴隆路5号(72)发明人 斯卫东　程绍红　王强　张春景　(74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限

公司 33224

代理人 沈自军(51)Int.Cl.

G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)

权利要求书1页 说明书9页 附图3页

CN 107643351 A(54)发明名称

一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法(57)摘要

本发明公开了一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，该方法包括：取待测的奥扎格雷钠样品，加盐酸水溶液溶解后，得到供试品溶液；利用高效液相色谱技术检测供试品溶液中的丁二酰亚胺，获得奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量。本发明以盐酸作为溶剂，先将待测的奥扎格雷钠样品中的溴代丁二酰亚胺全部转化为丁二酰亚胺，再采用特定参数条件的液相色谱技术进行检测，能够有效且准确的测定奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量，为奥扎格雷钠原料药杂质的鉴定提供理论依据，确保了奥扎格雷钠原料药及下游药品的品质。

CN 107643351 A

权　利　要　求　书

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1.一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，其特征在于，包括：

(1)取待测的奥扎格雷钠样品，加盐酸水溶液溶解后，得到供试品溶液；(2)以经过盐酸水溶液溶解的丁二酰亚胺标准品作为对照品溶液，利用高效液相色谱技术检测供试品溶液中的丁二酰亚胺，获得奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.05mol/L，奥扎格雷钠样品与盐酸水溶液的用量比为1mg:1ml。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件为：以CAPCELL PAK C18AQ 250mm×4.6mm 5μm色谱柱为填充剂；流动相A为0.02mol/L的磷酸二氢钾，流动相B为甲醇，流速为0.7ml/min，洗脱程序为线性梯度洗脱；柱温为30℃，检测波长为200nm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗脱程序中，磷酸二氢钾占流动相比例为：0～10min，100％；10～25min，100％；25～25.1min，60％；25.1～35min，100％；35min后，100％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的进液量为10～20μl。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用外标法对丁二酰亚胺进行定量。

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一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺

含量的方法

技术领域

[0001]本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法。

背景技术

[0002]奥扎格雷钠(sodium ozagrel)，化学名为反式-3-[4-(1H-咪唑-1-甲基) 苯基]-2-丙烯酸钠，是日本小野药品工业株式会社于1989年以商品名 Cataclot投放市场的首个血栓素合成酶抑制剂；其能阻碍前列腺素(PGH2) 生成血栓素(TXA2)，促使血小板所衍生的PGH2转向内皮细胞，内皮细胞用以合成PGI2，从而改善TXA2与前列腺素PGI2的平衡异常。奥扎格雷钠具有抑制血小板的聚集和扩张血管的作用。在临床上，奥扎格雷纳主要用于治疗急性血栓性脑梗死和脑梗死所伴随的运动障碍。[0003]目前，关于原料药奥扎格雷钠的合成工艺路线有多种，其中最常用的是将甲基肉桂酸酯类溴化得到对溴甲基肉桂酸酯类，对溴甲基肉桂酸酯类与咪唑反应得到奥扎格雷酯类，碱性水解后得到奥扎格雷钠。[0004]例如：申请公布号为CN102558061A的发明专利申请公开了一种奥扎格雷的合成方法，该方法将对甲基肉桂酸乙酯与N-溴代丁二酰亚胺反应得到对溴甲基肉桂酸乙酯；对溴甲基肉桂酸乙酯与咪唑反应得到奥扎格雷乙酯；奥扎格雷乙酯水解得到奥扎格雷粗品，经复合溶剂精制得到奥扎格雷。该发明方法制备获得的奥扎格雷纯度达99.8％以上，单个杂质小于0.1％，总杂质小于0.2％。

[0005]上述合成工艺因添加了N-溴代丁二酰亚胺，使得产品奥扎格雷中含有溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺两种杂质，而上述杂质如果在后续的处理过程中不能有效去除，就会残留在中间体咪唑甲基肉桂酸酯中，进而影响原料药和药品奥扎格雷钠注射液的品质。然而，一方面由于N-溴代丁二酰亚胺极不稳定，导致检测误差较大；另一方面，目前本领域中并没有用于检测上述合成工艺获得的奥扎格雷/奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺杂质的方法。[0006]因此，有必要提供一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，以保证原料药和药品的质量。发明内容

[0007]本发明公开了一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，该方法能够准确、有效地检测出奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量，确保奥扎格雷钠原料药的品质。

[0008]一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，包括：[0009](1)取待测的奥扎格雷钠样品，加盐酸水溶液溶解后，得到供试品溶液；[0010](2)以经过盐酸水溶液溶解的丁二酰亚胺标准品作为对照品溶液，利用高效液相

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色谱技术检测供试品溶液中的丁二酰亚胺，获得奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量。

[0011]N-溴代丁二酰亚胺为奥扎格雷钠溴化起始物料，而丁二酰亚胺为N- 溴代丁二酰亚胺反应产物，二者均具有一定毒性，由于二者均为亲水化合物和极性化合物，在常规C18柱中的保留能力很弱甚至根本不能保留；而CAPCELL PAK C18 AQ(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱对于上述亲水性和极性化合物具有更强的保留能力和选择性。[0012]为保证检测的准确性，本发明一方面向奥扎格雷钠样品中加入的0.05 mol/L盐酸水溶液，将奥扎格雷钠样品中的N-溴代丁二酰亚胺完全转化为稳定的丁二酰亚胺，利用CAPCELL PAK C18 AQ(250mm×4.6mm，5μm) 色谱柱进行高效液相层析，以外标法对奥扎格雷钠样品中的丁二酰亚胺进行准确定量，从而有效的检出目的产物中N-溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺残留量，以更好地控制药品的质量；另一方面通过梯度洗脱的方法，冲洗出色谱柱中残留的奥扎格雷钠，保证了色谱柱的正常使用。[0013]作为优选，所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.05mol/L，奥扎格雷钠样品与盐酸水溶液的用量比为1mg:1ml。

[0014]由于奥扎格雷钠在过酸的条件下会析出奥扎格雷，增加了检验的难度，0.05mol/L盐酸水溶液的使用，使得奥扎格雷钠样品中的N-溴代丁二酰亚胺能100％的转化成丁二酰亚胺，且对奥扎格雷钠样品不产生影响。[0015]作为优选，所述高效液相色谱的条件为：以CAPCELL PAK C18 AQ 250mm×4.6mm 5μm色谱柱为填充剂；流动相A为0.02mol/L的磷酸二氢钾，流动相B为甲醇，流速为0.7ml/min，洗脱程序为线性梯度洗脱；柱温为30℃，检测波长为200nm。[0016]作为优选，所述的洗脱程序中，磷酸二氢钾占流动相比例为：0～ 10min，100％；10～25min，100％；25～25.1min，60％；25.1～35min， 100％；35min后，100％。[0017]作为优选，所述高效液相色谱的进液量为10～20μl。[0018]作为优选，步骤(2)中，采用外标法对丁二酰亚胺进行定量。[0019]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0020]本发明以盐酸水溶液作为溶剂，先将待测的奥扎格雷钠样品中的溴代丁二酰亚胺全部转化为丁二酰亚胺，再采用特定参数条件的液相色谱技术进行检测，能够有效且准确的测定奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量，为奥扎格雷钠原料药杂质的鉴定提供理论依据，确保了奥扎格雷钠原料药及下游药品的品质。附图说明

[0021][0022][0023][0024][0025][0026]

图1为实施例1中系统适用性与仪器精密度试验的HPLC图。

图2为实施例1中丁二酰亚胺定量限的HPLC图。图3为实施例1中丁二酰亚胺检出限的HPLC图。

图4为实施例1中丁二酰亚胺峰面积对浓度的线性图。图5为实施例2中N-溴代丁二酰亚胺水溶液的HPLC图。

具体实施方式

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下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施

例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028]实施例1

[0029]一种检测奥扎格雷钠原料药中溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺含量的方法，具体步骤如下：[0030](1)取待测的奥扎格雷钠样品，加0.05mol/L盐酸水溶液溶解并稀释制成每1ml中约含1mg奥扎格雷钠样品的溶液，作为供试品溶液；[0031](2)取丁二酰亚胺标准品，用0.05mol/L盐酸水溶液溶解并稀释制成每1ml中约含1μg丁二酰亚胺标准品的溶液，作为对照品溶液；[0032](3)利用高效液相色谱技术检测供试品溶液中的丁二酰亚胺；其中，采用CAPCELL PAK C18 AQ(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相A 为0.02mol/L磷酸二氢钾(用10％氢氧化钾调节pH值至6.5)，流动相B 为甲醇，按下表1进行线性梯度洗脱，流速为0.7ml/min；柱温为30℃；检测波长为200nm。

[0033]表1线性梯度洗脱程序内容

[0034]

时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0 10 100 0 25 60 40 25.1 100 0 35 100 0 [0035]对上述分析方法进行方法学验证，主要内容有：系统适用性与仪器精密度、专属性、定量限与检测限、线性关系、回收率以及溶液稳定性；结果表明所有验证结果均符合可接受标准，表明本丁二酰亚胺分析方法通过验证，适用于本品中丁二酰亚胺及N-溴代丁二酰亚胺的总量控制。[0036]具体内容如下：[0037]以批号：20170416奥扎格雷钠作为验证用样品，并采用本实施例的色谱条件。[0038]1、系统适用性与仪器精密度试验[0039]结果如表2所示，可知：系统适用性溶液中主峰和各杂质面积RSD 均小于2.0％，各峰保留时间RSD均小于1.0％，理论板数大于3000，符合系统适用性及仪器精密度要求。[0040]表2仪器精密度试验结果

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2、方法专属性试验-峰定位

[0043]方法的专属性研究考察峰鉴别和选择性，分别取空白溶剂、各成分定位溶液及混合定位溶液分别进样，记录色谱图，并计算混合溶液中各相邻峰间的分离度。其中，空白溶剂(稀释剂)为0.05mol/L的盐酸；；丁二酰亚胺的定位溶液为称取丁二酰亚胺对照品约10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，取1ml，置10ml量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；N-溴代丁二酰亚胺的定位溶液为称取N-溴代丁二酰亚胺对照品约10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解稀释至刻度，取1ml，置10ml量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；供试品溶液为取供试品25mg，置25ml量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

[0044]结果如表3所示：空白溶剂无干扰峰，各相邻峰间的分离度不低于1.5，混合定位溶液中各峰的保留时间与单独进样基本一致。[0045]表3专属性-峰定位结果

[0046]

[0042]

3、定量限

[0048]配制丁二酰亚胺对照品贮备液：取丁二丁二酰亚胺对照品约10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，取该储备液用稀释剂稀释进样，直至峰信噪比约为10，即为定量限浓度。对定量限浓度进行验证，方法如下：配制主成分及各杂质的定量限浓度混合溶液6份，分别进样，计算保留时间RSD，要求RSD≤2.0％。[0049]结果如表4和5所示；[0050]表4定量限测定结果

[0047]

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[0052][0053]

表5定量限验证结果

结论：丁二酰亚胺的定量限均在报告阈值0.03％以下，可以对丁二酰亚胺有效定

量检测。[0055]4、检测限

[0056]对于丁二酰亚胺，检测限根据信噪比法来确定，取定量限溶液用稀释液稀释进样，直至峰信噪比≥3，即为检测限浓度。[0057]结果如表6所示；[0058]表6检测限测定结果

[0059]

[0054]

结论：丁二酰亚胺的检测限均在报告阈值0.03％以下，可以对丁二酰亚胺有效定

量检测。[0061]5、线性关系

[0062]对于已知杂质，在定量限浓度至限度的150％浓度范围内，至少配制 6个浓度水平的溶液进行研究。线性关系以响应值(峰面积)对已知杂质浓度作图，并用最小二乘法进行线性回归。要求回归线的相关系数 R≥0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差 (RSD)≤10％。取丁二酰亚胺适量，用0.05mol/L盐酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液作为线性储备液。分别精密吸取储备液0.2ml，0.5ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.5ml置10ml量瓶用0.05mol/L 盐酸水溶液溶解摇匀,精密量取20μl注入液相色谱仪，记录图谱。[0063]溶液配制。杂质线性溶液配制：分别量取杂质对照贮备液适量，加稀释液稀释配制LOQ浓度及约相当于杂质限度浓度20％、50％、80％、100％、 120％和150％的溶液。[0064]结果如表7所示；

[0065]取上述各系列溶液分别进样，记录峰面积。并以供试液的浓度对相应的峰面积作

[0060]

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回归曲线，计算回归方程和相应的线性相关系数，结果丁二酰亚胺在0.02～1.488μg/ml浓度范围内(相当于供试品浓度的0.002％～0.15％，丁二酰亚胺限度浓度的1.98％～148.79％)，丁二酰亚胺峰面积与浓度呈良好的线性关系。[0066]表7丁二酰亚胺峰面积对浓度线性试验结果

[0067]

[0068]

6、回收率

[0070]由于本发明是将N-溴代丁二酰亚胺完全转化为丁二酰亚胺，然后通过对丁二酰亚胺总量的测定，确定样品中N-溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺的总含量，故将回收率分为两步进行。[0071]第一步：N-溴代丁二酰亚胺的回收率[0072]取N-溴代丁二酰亚胺对照品适量，用0.05mol/L盐酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含100μg N-溴代丁二酰亚胺的溶液，作为N-溴代丁二酰亚胺储备液。[0073]取奥扎格雷钠10mg，共9份，置10ml量瓶，分别加入N-溴代丁二酰亚胺储备液0.05ml，0.1ml和0.12ml各3份。另取丁二酰亚胺对照品适量，用0.05mol/L盐酸水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含1μg的溶液，作为回收率对照品溶液。[0074]取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，外标法计算N-溴代丁二酰亚胺的测得量(N-溴代丁二酰亚胺的分子量为177.98，丁二酰亚胺的分子量 99.09)。[0075]结果如表8所示，N-溴代丁二酰亚胺回收率为97.38％～102.21％，均在85％～115％范围内；回收率RSD为0.09％～2.5％，均小于10％，符合规定。[0076]表8N-溴代丁二酰亚胺回收率试验结果

[0069]

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第二步：丁二酰亚胺的回收率

[0079]以丁二酰亚胺对照品替代N-溴代丁二酰亚胺对照品，按第一步操作进行，结果如表9所示，丁二酰亚胺回收率为97.29％～100.40％，均在 85％～115％范围内；回收率RSD为0.16％～1.46％，均小于10％，符合要求。[0080]表9丁二酰亚胺回收率试验结果

[0081]

[0078]

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结论：本发明所设定的检测方法均可定量的检出N-溴代丁二酰亚胺和丁二酰亚胺

的总量。[0084]7、溶液的稳定性

[0085]为了考察溶液随时间变化的规律，分别在配制后不同时间进行检测，考察杂质含量的变化，并与0时进行比较，要求：对照品溶液主峰峰面积 RSD≤2.0％；供试品溶液中杂质含量RSD≤5.0％。以此确认经0.05mol/L盐酸水溶液溶解后的样品溶液的稳定性。[0086]取对照溶液和供试品溶液，每隔一定时间进样，记录图谱，计算丁二酰亚胺含量RSD，考察样品溶液的稳定性。[0087]结果如表10、11所示，在室温下放置24小时，杂质对照品溶液峰面积RSD小于5.0％；供试品溶液中均为检出杂质。结果表明各溶液在室温下非常稳定。[0088]表10对照品溶液稳定性试验结果

[0089]

[0083]

[0090][0091]

表11奥扎格雷钠供试品溶液稳定性试验结果

[0092]

对比例1

[0093]以水作为溶剂制备各溶液

[0094]①N-溴代丁二酰亚胺定位溶液：称N-溴代丁二酰亚胺11.17mg置 100ml量瓶，用水溶解并稀释至刻度，取2ml至20ml量瓶，用水稀释至刻度。[0095]②丁二酰亚胺定位溶液：称丁二酰亚胺10.01mg置100ml量瓶，用水溶解并稀释至刻度，取1ml至10ml量瓶，用水稀释至刻度。[0096]③空白溶剂：水。

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本对比例用水替代了供试品溶液和对照品溶液采用的盐酸进行研究；除溶剂类型

不同外，其余液相色谱的检测条件与实施例1相同。[0098]结果如表12所示，由于N-溴代丁二酰亚胺在水溶液中不稳定，部分脱溴后转化为丁二酰亚胺，因此进样后出现两个主要的色谱峰，且N-溴代丁二酰亚胺主峰保留时间仅为4.163min，易受到溶剂峰干扰。

[0099]表12采用水作为溶剂的N-溴代丁二酰亚胺对照品检测结果

[0100]

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图1

图2

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图3

图4

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图5

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