(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 108950086 A(43)申请公布日 2018.12.07
(21)申请号 201810994243.X(22)申请日 2018.08.29
(71)申请人 浙江国际旅行卫生保健中心（浙江
出入境检验检疫局口岸门诊部）
地址 310000 浙江省杭州市西湖区文三路2
号
申请人 江苏奇天基因生物科技有限公司(72)发明人 郑伟 王刚 麻慧君 杨永耀
吴忠华 郭利川 汤赛君 王智宏 应清界 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 刘奇(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01)
(54)发明名称
基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒(57)摘要
本发明提供了基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组以及试剂盒，属于分子生物学技术领域，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。本发明还提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物对和探针；所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明提供的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，能在5～15min内检测出西尼罗病毒RNA。
C12R 1/93(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页
序列表1页 附图2页
CN 108950086 ACN 108950086 A
权 利 要 求 书
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1.基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
4.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光猝灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
5.一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，其特征在于，还包括权利要求1所述的引物探针组；所述引物探针组中的引物对和探针以混合溶液的形式存在。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.2mM。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中探针的浓度为0.01～0.03mM。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为200mM的Tris-HCl缓冲液、浓度为260mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中包括西尼罗病毒的基因组DNA；所述西尼罗病毒的基因组DNA的浓度为1×104Copies/μl。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为ddH2O或纯化水。
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说 明 书
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基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒。
背景技术
[0002]西尼罗病毒(WestNile virus，WNV)病是一种烈性人畜共患疾病，1937年在乌千达北部尼罗河地区首先发现而得名。近年来西尼罗病毒感染在欧洲、中东、西亚和俄罗斯等地区和国家频频发生，成为近年来影响美国最大的传染病。西尼罗病毒是经库蚊等嗜鸟蚊传播，以鸟类为主要动物宿主的黄病毒。人、马和其他哺乳动物在被西尼罗病毒感染的蚊虫叮咬后而发病，轻者出现发热、头痛等流感样症状(西尼罗热)，重者可表现为中枢神经系统症状(西尼罗脑炎)，甚至死亡。
[0003]西尼罗病毒属于黄病毒科黄热病毒属，与乙型脑炎，圣路易脑炎，黄热病，登革热，日本脑炎，丙型肝炎等病毒同属，有囊膜，单链线形核糖核酸，RNA为正链，约有10000～11000个碱基对，具有感染性。电镜下该病毒呈中等大小，直径21nm～60nm，圆形颗粒，对有机溶剂，紫外线敏感。[0004]近年来，由于国际合作的加深，各国间贸易往来频繁，旅行者数量逐年递增，这些都增大了西尼罗病毒传入我国的可能性。因此，在国境口岸建立该病毒的快速检验方法，并应用于口岸西尼罗病毒的监测工作，对防治该病传入我国具有重要意义。[0005]西尼罗病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serum neutra1ization test，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-1inked1munosorbent assays，ELISA)、PCR检测等病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但西尼罗病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行；血清中和试验(Serum neutralizationtest，SNT)和酶联免疫吸附检验(Enzyme-1inked immunosorbent assays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高，PCR检测具有快速，准确的特点，也被广泛用于对西尼罗病毒的检测，如聚合酶链式反应(RT-PCR)以及等温核酸技术中的RT-LAMP法，大大缩短了检测的时间。以RT-PCR技术为代表如多重RT-PCR、RT-巢式PCR以及实时定量RT-PCR以其高度的特异性及敏感性在西尼罗病毒检测方面取得了重大的突破，但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。等温核酸技术中的RT-LAMP方法克服了RT-PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但是，RT-LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性率也比较高。发明内容
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒，实现西尼罗病毒的简单、快速和灵敏的现场检测。[0007]基于上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：基于RAA荧光法检测西尼罗病毒
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的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；所述下游序列具有如SEQ IDNo.2所述的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。[0008]优选的，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。[0009]优选的，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。[0010]优选的，所述荧光猝灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。[0011]本发明还提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括所述的引物探针组；所述引物探针组中的引物对和探针以混合溶液的形式存在。[0012]优选的，所述引物对中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.2mM。[0013]优选的，所述探针的浓度为0.01～0.03mM。[0014]优选的，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为200mM的Tris-HCl缓冲液、浓度为260mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。[0015]优选的，所述阳性质控品中包括西尼罗病毒的基因组DNA；所述西尼罗病毒的基因组DNA的浓度为1×104Copies/μl。[0016]优选的，所述阴性质控品为ddH2O或纯化。[0017]本发明的有益效果：本发明提供的基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，能够在样本中西尼罗病毒浓度较低的情况下，快速、准确的实现西尼罗病毒的RNA扩增。
[0018]本发明提供的基于RAA荧光法检测西尼罗病毒试剂盒，能方便快速准确地鉴定西尼罗病毒，操作简便，检测时间短，15min内完成检测；无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，可实现在恒温30～42℃下进行等温扩增即可完成检测，对设备要求低。也无需像LAMP技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增(容易产生假阳性)；引物序列少，假阳性低。[0019]利用本发明提供的试剂盒检测西尼罗病毒的方法速度快、通量高，降低了检测时间和检测成本，研究表明本发明提供的基于RAA荧光法快速检测西尼罗病毒的试剂盒，检测西尼罗病毒时与其他虫媒传染病乙脑、登革热病、黄热、基孔肯雅无交叉反应，特异性强，特异性达100％；灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10Copies。
[0020]本发明提供的基于RAA荧光法快速检测西尼罗病毒的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。附图说明
[0021]图1为不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果；[0022]图2为西尼罗病毒质粒DNA重复性检测结果；[0023]图3为西尼罗病毒的特异性检测结果。
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具体实施方式
[0024]本发明提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组，包括引物对和探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：cacagatgtcatcacgattccaacagctgc；所述下游序列具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：cttctggatcattaccagccgacagcactg。在本发明中，所述引物序列是根据西尼罗病毒高度保守序列设计获得；所述西尼罗病毒高度保守序列如SEQ ID No.4所示：ctctaacttccaagggaaggtgatgatgacggtaaatgctactgacgtcacagatgtcatcacgattccaacagctgctggaaagaacctatgcattgtcagagcaatggatgtgggatacatgtgcgatgatactatcacttatgaatgcccagtgctgtcggctggtaatgatccagaagacatcgactgttggtgcacaaagtcagcagtctacgtcaggtatggaagatgcaccaagacacgccac。在本发明中所述西尼罗病毒高度保守序列是根据西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和b1ast序列分析筛出获得。[0025]本发明中，所述探针的序列具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列：cagagcaatggaygtgggatacatgtgygatgatactatcacttatgaat。在本发明中，所述探针为荧光探针，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。在本发明中，所述荧光报告基团优选为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；更优选为FAM或HEX；所述荧光猝灭基团优选为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3，更优选为BHQ1或BHQ2。
[0026]本发明提供了一种基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括上述引物探针组；所述引物对和探针以混合溶液的形式存在。
[0027]本发明所述试剂盒中包括引物探针组，所述引物对和探针以混合溶液的形式存在。其中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：CACAGATGTCATCACGATTCCAACAGCTGC；所述下游序列具有如SEQ IDNo.2所述的核苷酸序列：CTTCTGGATCATTACCAGCCGACAGCACTG。在本发明中，所述引物对中上游引物的浓度优选为0.05～0.2mM，更优选为0.1mM；所述引物对中下游引物的浓度优选为0.05～0.2mM，更优选为0.1mM。
[0028]本发明所述探针的序列具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列：CAGAGCAATGGAYGTGGGATACATGTGYGATGATACTATCACTTATGAAT。在本发明中，所述探针为荧光探针，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数17bp的T碱基位置上，所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。在本发明中，所述荧光报告基团优选为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；更优选为FAM或HEX；所述荧光猝灭基团优选为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3，更优选为BHQ1或BHQ2。本发明中，所述探针的浓度优选为0.01～0.03mM，更优选为0.02mM。[0029]本发明所述试剂盒中还包括RAA基础荧光通用反应试剂，所述RAA基础荧光通用反
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应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本发明实施例中RAA基础荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001，反应规格为50ul，使用前用反应缓冲液进行重溶。本发明中所述RAA基础荧光通用反应试剂的主要成分包括重组酶，本发明中所述RAA基础荧光通用反应试剂的作用完成DNA的扩增。[0030]本发明所述试剂盒中还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为200mM的Tris-HCl缓冲液、浓度为260mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。在本发明中，所述Tris-HCl的pH为8.0。本发明中，所述Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 10000的浓度均为在反应缓冲液中的终浓度。本发明对所述Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中所述Tris-HCl、和PEG20000的购自Sigma-Aldrich，MgAc购自国药沪试。本发明中所述反应缓冲液的作用是溶解上述试剂盒中的RAA基础荧光通用试剂。
[0031]本发明中所述试剂盒还包括阳性质控品，在本发明中所述阳性质控品中包括西尼罗病毒的基因组DNA；所述西尼罗病毒的基因组DNA的浓度优选为1×104Copies/μl。本发明实施例中所述阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。本发明中，所述试剂盒还包括阴性质控品，所述阴性质控品优选为ddH2O或纯化水。[0032]在本发明中，上述方案所述的基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：A)提取待测样品中的RNA获得RNA提取液；B)将所述RNA提取液与反应预混液在38～42℃反应15～25min；C)将反应后的溶液进行荧光信号检测；根据检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值K≥20时，判定为阳性，斜率值K＜20时判定为阴性。[0033]在本发明中，提取待测样品(疑似西尼罗病毒)的RNA，提取方法可以采用市售商品化的病毒核酸提取试剂，按说明书进行操作。本发明具体实施过程中，采用西安天隆的核酸自动提取仪，选用西安天隆的配套病毒RNA核酸提取试剂进行RNA的提取；提取得到的RNA-20℃保存备用；待测样本由浙江国际旅行保健中心提供。[0034]本发明在获得所述RNA后，将提取获得的RNA与反应预混液混合。在本发明中，所述反应预混液包括RAA基础荧光通用反应试剂、反转录酶、反应缓冲液、探针和引物。在本发明中，所述反应预混液的体积优选为45μl。本发明优选的先将所述RAA基础荧光通用反应试剂溶解于反应缓冲液中，然后将上述成分混合获得反应预混液。本发明中，所述反应预混液中包括反应缓冲液42.7μL，探针1μL、引物1μL，反转录酶0.3μL和一反应份的RAA基础荧光通用反应试剂。本发明中，所述反应预混液与RNA的体积比优选为9:1。本发明中所述反转录酶优选为PromegaM-MLV(200U/μL)或Takara M-MLV(200U/μL)。本发明中直接将所述反转录酶与RAA基础荧光通用反应试剂混合，反转录RNA与扩增在同一体系内进行，直接实现一步法RT-RAA检测西尼罗病毒。
[0035]本发明中所述反应优选的在检测仪器RAA-F1620中进行；所述反应的温度优选为38～42℃，更优选为40℃，所述反应的时间优选为15～25min，更优选为20min。[0036]本发明在所述反应结束后，将所述溶液放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；在本发明具体实施过程中，根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值K≥20时，判定为阳性；斜率值K＜20时判定为阴性。
[0037]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
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CN 108950086 A[0038]
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实施例1
[0039]基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的试剂盒检测灵敏度实验[0040]试剂盒组成包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，引物对和探针。具体组分组成和规格见表1。[0041]表1试剂盒成分表
[0042]
其中，上游引物序列：
[0044]5’-CACAGATGTCATCACGATTCCAACAGCTGC-3’；[0045]下游引物序列：[0046]5’-CTTCTGGATCATTACCAGCCGACAGCACTG-3’。[0047]探针序列：
[0048]CAGAGCAATGGAYGTGGGATACATGTGYGATGATACTATCACTTATGAAT[0049]采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；[0050]修饰后的探针为：
[0051]CAGAGCAATGGAYGTGGGATACATGTGYGA(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)ACTATCACTTATGAAT；[0052]检测方法：[0053]制备好的重组质粒工作标准品，分别为：[0054]工作标准品1，含有1.0×106Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。[0055]工作标准品2，含有1.0×105Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。[0056]工作标准品3，含有1.0×104Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。[0057]工作标准品4，含有1.0×103Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。[0058]工作标准品5，含有1.0×102Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。[0059]工作标准品6，含有1.0×101Copies/ul西尼罗病毒质粒非传染性DNA片段。
[0043]
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CN 108950086 A[0060]
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灵敏度实验实施方法：
[0061]1、反应缓冲液的配制
[0062]从试剂盒中反应缓冲液管里吸取301μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入16μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol，引物的浓度为0.1mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。[0063]2、RAA荧光反应试剂重溶
[0064]准备7个RAA荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μL分别加入到准备好的7个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系。[0065]3、加样反应
[0066]在以上7个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品6、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2、5μL标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。[0067]将反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。检测结果如附图1所示。结果显示最快5min明显有扩增，15min内所有标准工作品均有扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×101Copies，即在每个反应管中存在10Copies，就可以在15min内检测出来，表明本发明灵敏度高。[0068]实施例2[0069]重复性实验[0070]引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。[0071]试剂盒组成如表2所示：[0072]表2试剂盒成分表
[0073]
[0074][0075]
反应缓冲液配制：
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取173μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，
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再加入8μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.1mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
[0076]2RAA荧光基础反应试剂重溶
[0077]准备4个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系，并做好标记。[0078]3、加样反应
[0079]在以上4个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、其他3个反应管中分别加入5μL西尼罗病毒质粒DNA；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。
[0080]将混匀的4个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。检测结果如附图3所示。结果显示扩增反应重复性好。[0081]实施例3[0082]特异性实验[0083]引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。[0084]试剂盒组成如表3所示：[0085]表3试剂盒成分表
[0086]
特异性实验中乙脑、登革热病、黄热、基孔肯雅样本来源
[0088]其中乙脑、登革热病样本由浙江国际旅行保健中心提供，并通过西安天隆全自动核酸提取仪提取病毒RNA，黄热病毒RNA从黄热疫苗中提取所得、基孔肯雅质粒DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。[0089]实施方法：
[0090]1反应缓冲液的配制
[0091]样本RNA反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取127.8μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入6μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引
[0087]
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物的浓度为0.1mM)，再加入0.9μL PromegaM-MLV(200U/μL)反转录酶，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液1。
[0092]DNA反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取130μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入6μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.1mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液2。[0093]2RAA荧光基础反应试剂重溶
[0094]准备3个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液2分别加入到准备好的3个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系，并做好标记。[0095]另准备3个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液1分别加入到准备好的3个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RT-RAA反应体系，并做好标记。[0096]3、加样反应
[0097]在以上3个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL基孔肯雅质粒DNA、5μL西尼罗病毒质粒DNA；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。在以上3个配制好的RT-RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL乙脑病毒RNA、5μL登革热病病毒RNA、5μL黄热病毒RNA为模板，每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。[0098]将混匀的6个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。检测结果如附图3所示。结果显示只有西尼罗病毒质粒DNA有扩增，为阳性，其他样本如乙脑病毒RNA、登革热病病毒RNA、黄热病毒RNA、基孔肯雅质粒DNA及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本发明提供的检测方法特异性强。[0099]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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序 列 表
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序列表<110> 浙江国际旅行卫生保健中心（浙江出入境检验检疫局口岸门诊部）江苏奇天基因生物科技有限公司<120> 基于RAA荧光法检测西尼罗病毒的引物探针组及检测试剂盒<160> 4<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 30<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1cacagatgtc atcacgattc caacagctgc 30<210> 2<211> 30<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2cttctggatc attaccagcc gacagcactg 30<210> 3<211> 50<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3cagagcaatg gaygtgggat acatgtgyga tgatactatc acttatgaat 50<210> 4<211> 250<212> DNA<213> West Nile virus<400> 4ctctaacttc caagggaagg tgatgatgac ggtaaatgct actgacgtca cagatgtcat 60cacgattcca acagctgctg gaaagaacct atgcattgtc agagcaatgg atgtgggata 120catgtgcgat gatactatca cttatgaatg cccagtgctg tcggctggta atgatccaga 180agacatcgac tgttggtgca caaagtcagc agtctacgtc aggtatggaa gatgcaccaa 240gacacgccac 250
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