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一种提取动物基因组总!\"#的野外样品保存方法
，，!，张同作%，连新明%!，慈海鑫%!，苏建平%!蔡振媛%，
（；%7中国科学院西北高原生物研究所，西宁&%\"\"\"&!7中国科学院研究生院）
摘要：为了确定一种方便的野外动物样品保存方法，以新鲜材料作对照，从$!\"=冰箱、>\"?乙醇、含#\"／**5-@(ABC的>\"?乙醇、’#?乙醇、液氮处理的高原鼠肌肉和肝脏组织中提取基因组总ADC。通过琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的基因组总ADC质量进行检测。结果显示：相同处理的肝脏ADC产量大，肌肉组织提取的ADC质量好；各种保存方法提取的ADC降解程度依次为，$!\"=冰箱、>\"?乙醇\"含#\"／**5-@(ABC的>\"?乙醇、’#?乙醇\"液氮\"新鲜。选择新鲜肌肉和’#?酒精处理的肌肉样品提取的总ADC作模板，进行微卫星EFG扩增，均可获得清晰的电泳带。将该方法用于高原鼢鼠，进行线粒体%!HIGDC、F63
!和A)-55#?乙醇固定肌肉样品9区测序，结果显示该方法保存的样品与新鲜样品没有差别。因此，在野外用’是一种可行的样品保存方法。
关键词：野外取样；高原鼠兔；高原鼢鼠；样品保存方法；总ADC提取中图分类号：J>&
文献标识码：C
文章编号：（）%\"\"\"$>\"&K!\"\"L\"K$\"M>K$\"#
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%’’!年_5-1.4-+I(.5-5R3在英国正式创刊，
标志着分子生态学已经成为生态学的一个新分支学
［］
科。发刊词中X4IZ1等%提出分子生态学应用分子
［］%，即K类检测生物自然种群A和引物DC序列多
态性的方法。无论采用哪种方法开展分子生态学研究，样品的采集都是十分重要的，取样方法和样品保存将直接关系到研究能否顺利进行。ADC质量
是影响分子实验结果的关键因素之一，不同的实验
生物学方法为生态学和种群生物学各领域提供革新见解。X4IZ1提出分子生态学技术包括探针、序列
收稿日期：!\"\"#$%\"$!&作者简介：蔡振媛（，女，硕士研究生，研究方向：分子进化生物学，(：%’&%!）)*+,-.+,/0124+2\"056*+,-7.5*3
!通讯作者，
万方数据 ：()*+,-:4\"2;,<7+.7.2899
M>K
四川动物$’’4年第$&卷第%期
+,-./0123/4105367335335?$&%3?%$’’489:
方法对样品!\"#的质与量的要求也不相同，确立一种能够满足特定研究方法的样品保存方法一直是开展分子生态学研究的重要问题。
脊椎动物的肌肉、心脏、肝、肾、脾等器官组织都是!\"#的良好来源，其中肝脏的!\"#产量最大，而从肌肉组织提取的!\"#质量最好。新鲜组织的!\"#产量高，质量好。在野生动物的研究中，把大量野外采集的活标本带到实验室十分困难，对于新鲜组织最好的保存方法是冷冻，马上和
@&/乙醇的3?&(*离心管中固定，$0小时内换固
定剂一次。一周后从$’份保存的肝脏、肌肉组织进行基因组总!\"#的提取。整个实验过程各种解剖用具、实验器材严格灭菌，不同个体分开使用，杜绝!\"#的交叉污染以及外源!\"#侵染。!\"#总$%&的提取
参照6A(B7))C等用蛋白酶D和苯酚从哺乳动
［］
物细胞中分离高分子质量!\"#的方法@提取总
!\"#，部分步骤加以改进。经固定剂固定的样品，液氮或干冰保存在一起［$］。但是在野外，一般不
具备马上提取!\"#或冷冻的条件。至于样品的保
存，王义权等［%］认为使用含&’(()*／+,!-#的
’/乙醇作为固定剂保存样品，不影响!\"#的提
取和扩增结果，张建珍等［0］认为保存完好的干标本、1$’2冷冻标本和3’’/乙醇浸泡标本是蝗虫分子系统学研究中首选的%种保存方式，刘保忠
等［&］研究表明，海湾扇贝采用冷冻保存和.’/乙
醇固定的样品可以得到很好的!\"#，其质量和得
率与鲜活样品没有显著差异，张海琪等［4］对大黄
鱼肌肉样品的研究结果与上述类似。
微卫星多态性［.］和!\"#测序［5］可以提供具高
分辨率的遗传信息，是分子生态学最具应用潜力的分子多态性检测手段。
本文以小型哺乳动物高原鼠兔为例，利用不同处理方法保存的不同组织样品，提取基因组总\"#，研究比较了提取的总!\"#质量差异，选择
最优保存方法提取的总!\"#用于微卫星指纹图谱分析。并进一步将该方法用于高原鼢鼠野外样品保存，提取!\"#进行测序，结果表明该方法完全能够满足线粒体3$678\"#、9:;!和!<*))=区序列多样性研究。
材料和方法
\"!材料及处理
在中国科学院海北高寒草甸生态系统定位站，用绳套法捕捉高原鼠兔$只，带回实验室，分别颈椎脱臼法处死，迅速切取肝脏、肌肉组织各3’>左右，分别分成4份，3份装入3?&(*灭菌离心管，置于液氮中速冻，3份装入样品袋，置于冰箱中，1$’2中冷冻保存，3份切碎装入盛有5’’!*细胞裂解液（成分见下）的3?&(*离心管中，进行!\"#的提取，另外%份分别置于盛有约3’’’!*的.’/乙醇、含&’(()*／+,!-#的.’/乙醇、
0.0
万 方数据取出后用三蒸水冲洗表面，然后用滤纸吸干。取约%’’(>组织，置于无菌玻璃板上切碎，转移至3?&(*,==EFG)7H管中，加入.’’!*细胞裂解液［3’(()*／+
-7IJ ,!-#（=K5?’），’?&/（(／L）6!6］，漩涡震荡器上混匀，加入0!*蛋白酶D（$’(>／(*），3?&! *8\"AJE#（3’(>／(*），上下颠倒混匀，&&2水浴消化约0小时，不时轻摇混匀，直至溶液完全透明。冷却至室温后，加入4’’!*-7IJ·饱和酚，温和的上下颠倒5(IF至水相成乳状液，023$’’’7／(IF5(IF。转移上清液至另一,==EFG)7H管中，加入4’’!*氯仿M异戊醇（$0M3），上下颠倒混匀5(IF，023$’’’7／(IF5(IF，转移上清液至另一,==EFG)7H管中。可重复酚氯仿抽提，直至上下界面无蛋白质沉淀。加入5’’!*预冷的无水乙醇1$’2沉淀!\"#3小时。023’’’’7／(IF离心5 (IF，弃上清，用预冷的.’/的酒精5’’!*洗涤沉淀$次。干燥!\"#，溶于%’’!*-,［3’(()*／+ -7IJ !\"’\"!紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测总!\"#母液用灭菌三蒸水稀释&’倍后利用紫外分光光度计测$4’F(和$5’F(的光吸收，计算!\"#浓度和#$4’／#$5’值，分析得率与!\"#的纯度。然后各取母液$!*，用含,O（’?&!>／(*）的3/的琼脂糖凝胶电泳检测，0P／Q(恒压电泳@’(IF，凝胶成像系统观察拍照，分析所得!\"#含8\"#及降解情况。 !\"’\"#()*扩增和测序 高原鼠兔微卫星位点 .!!!四川动物’))I年第’E卷第P期 )，使用!\"#扩增，选择引物$%’(*+,-./0123&4015+.6/27.0-,89,%:!\"#仪进行扩增，基本程序 ［ ］ \"#$%&’()*&+(’,*-.**,**,D’E2*DP’))I/01 的?／<=产量大于肌肉组织。?<==’I)=’J)值在肝脏样品(DK)))左右，肌肉样品(DLE))左右，这说明肝脏组织提取的<=中#<=含量高于肌肉组织，而肌肉组织提取的?<=蛋白质及苯酚含量高于肝脏组织。 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：M’)N冰箱、L)F的乙醇保存的样品提取的?<=，出现明显的 “跑道”现象，降解最严重；含E／)--,9OB?2=的L)F乙醇、KEF乙醇处理的样品，有轻微的“跑道”现象，说明有降解但并不严重；液氮保存的样品，在总?<=主带上方有“拖尾”现象，但没有形成“跑道”，说明只有轻微的降解；肝脏样品比肌肉样品总?<=带亮，这表明肝脏的?<=产量大于肌肉组织；同时相同保存方法的肝脏组织降解程度相对高于肌肉组织，并且在前端有较亮的降解不完全的#）。<=带（图( 按常规方法进行，反应体系及条件参考相关文 ［］()。参照文献［，］的引物进行高原鼢鼠献(((’ 线粒体(39,,\"#’;0#<=、\"/!和?&的扩增，!> 扩增后，以扩增产物为模板，利用全自动测序仪@.1*=\"B直接进行测序。基本程序按常规方法A ［，］(((’进行，反应体系及条件参考相关文献。引物在上海生工合成，2、@15<2!10:3C酶、 ／1:101公司，扩增产物用含B*（)DE!.0购自2A ）的(／-9DEF的琼脂糖凝胶电泳检测，EG%-恒压电泳’，凝胶成像系统观察拍照。测序结)-+6果应用软件\"70,-1H分析。 !结果 紫外分光光度计检测’I)6-光吸收肝脏样品)D(E))左右，肌肉样品)D()))左右，这表明肝脏 图(高原鼠兔总?<=鉴定电泳图谱 ：分子量标记，箭头所指带为(；：高原鼠兔总?(KP’E8’\"’E<=，其中偶数来自肌肉组织，奇数来自肝脏组织，处理方法如图示（’\"&，M，，含E／，K，液氮冻E’)N冰箱保存，I\"KL)F的乙醇固定，()\"(P)--,9OB?2=的L)F乙醇固定，(Q\"(LEF乙醇固定，(J\"’(存，，新鲜组织）’’\"’E 图’!\"#扩增产物检测电泳图谱 ，高原鼢鼠(，高原鼢鼠：分子量标记，箭头所指带分别为(、；，高原鼢鼠\"E\"I’;0#<=全序列；L\"K()P)8Q))8’\"Q/!全序列；&&> ，高原鼠兔微卫星片段39,,()\"(’&区部分序列； 万方数据 QLE 四川动物%AA:年第%9卷第1期 \"#$%&’()*&+(’,*-.**,**,<%92*<1%AA:/01 高原鼠兔微卫星!\"#扩增产物及高原鼢鼠线粒体$!和,-.//%&’#()、\"+0的扩增电泳结果* 如图%所示，图1显示的是高原鼢鼠,-.//0区的部分序列。 图1高原鼢鼠,-.//0区的部分序列示意图 !分析讨论 总,()的质量包括完整性和纯度。,()提取前后的核酸酶的作用及,()提取过程中的机械剪切等都会造成,()的降解，从而影响提取的,()的完整性。细胞内,()的降解，主要是一种内源性核酸内切酶的作用，发生在生物死亡后的几个小时内。提取过程中的生物降解，过酸、过碱，机械剪切、高温等有害因素都会造成,()的降解。机械剪切力是主要的物理降解因素，包括强力高速的溶液震荡，搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及 1。因此，,()样品的反复冻融$,()提取过程动作应尽量缓慢轻柔，在保证去除蛋白的前提下， ［ ］ 都有最适反应浓度，（）蛋白酶5能使6%27酶失活，（1）,()模板中蛋白质的含量会明显影响!\"#扩增。所以,()提取中#(234)和蛋白酶5的用量只可适当增大，并且提取过程中一定要保证去除#(234)和蛋白酶5。 乙醇和甲醛作为常用固定剂，都能较快地渗入细胞内部，促使蛋白质变性，各种水解酶很快失活，从而达到保存,()的作用。研究表明，,()在乙醇中可保存较长时间，这说明乙醇对,()没 ［］$8，并且乙醇固定的样有或仅有较弱的降解作用 品受保存温度影响很小，常温下$个月内提取的 ［9］ 。乙醇作为固定剂被广泛应,()几乎没有降解$ 用于样品的保存，并且提取的,()质量［，，］1!:$:$;好，与新鲜样品差别不明显。乙醇固定 尽量减少酚／氯仿抽提次数，简化操作步骤，缩短提取过程，存储的,()尽量减少反复冻融次数，从各个环节最大限度减少对,()的破坏。 琼脂糖凝胶电泳结果显示，从肝脏组织提取的,()更容易受到#()污染，这是由于肝脏是物质 代谢的中心，是人体蛋白质合成的主要器官，肝脏中,()、#()含量均远远高于其他组织，也因为这一点，肝脏组织,()得率也高。紫外分光光度计检测结果显示，相同提取流程，肌肉组织提取的,()蛋白质含量明显高于肝脏组织提取的结果，这是由于肌肉组织含有许多肌纤维的原因，但由于肌肉组织比肝脏组织含有较少的降解,()的核酸酶，所以更容易得到更大片段的高质量,()。因此，从肝脏组织提取,()可以在裂解液中适当加大#(234)的浓度，肌肉组织作为提取,()的材料时，可以适当提高蛋白酶5的浓度或者增加抽提次数。同时必须注意：（）$#(234)和蛋白酶5 万方数据 8;: 样品时，应保证足够的乙醇用量，如果野外采样没有足够大的容器用于固定样品，可采用多次更新固定液的方法，同样可以取得满意的结果。甲醛固定的材料，较难提取到好的,()样品，因为甲醛具有,蛋白质分子的交联作用，当()-,()、,()-［?］ ，固定浓度大于;／<9\"=/.>时表现出断裂作用$ 样品的,()分子产生交联作用，,()抽提时与蛋 白等产生共沉淀进入酚相。另外，甲醛氧化后形成 ［9］ 研的甲酸对,()有较强的降解作用。罗晨玲等$ 究认为，分子生物学实验应尽量避免使用甲醛固定 的标本。针对甲醛固定标本提取,()的弊端，徐 ［］$@来祥等提出了一种新方法，通过梯度酒精等对标本进行预处理，从浸泡在福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取基因组,()，再进一步用透析法纯化,()，所得总,()质量较理想，但也不推荐利用甲醛来固定样品。 紫外分光光度计检测结果表明肝脏的,()产 四川动物%&&N年第%*卷第M期 \"#$%&’()*&+(’,*-.**,**,^%*2*^M%&&N/01 量大于肌肉组织，肌肉组织提取的!\"#微量蛋白质含量高于肝脏组织。从琼脂糖凝胶电泳检测结果可以看出：与新鲜材料相比，$%&’冰箱、(&)的乙醇保存的样品降解最严重，含*／&++,-./!0#的(&)乙醇、1*)乙醇处理的样品降解不严重，液氮保存的样品只有轻微的降解；肝脏组织2\"#含量高于肌肉组织，相同保存方法的肝脏组织降解程度相对高于肌肉组织。由于大容积液氮罐在野外取样中携带不便，存在泄漏、冻伤隐患，小容积液法就可以获得高质量的基因组总!\"#，完全能够满足微卫星指纹图谱分析和线粒体序列分析的需要。 !参考文献 ［］）［E］，3<=5>?0，4?@A-?52，4+@8BC（/A@8,5@D-FE,-?G/G,-，：311%33F ［］［E］%C@--@H!E，6E,5@8IFE,-?G=-D54H8?+D8@GHF4@JD=?5#HH,G@97 ：，，，：=JA?5-DJAEDHHDGB=H?88HL4#311&MN!MOFD8?HKJG4 ［］王义权，周开亚，徐珞珊，等F不同固定剂保存动物标本对M ［］，（）：反应的影响动物学杂志，氮罐由于液氮容易挥发，保持期限短，液氮冻存不适用于长途野外样品采集工作。不同浓度的乙醇固定法中，含*&++,-／./!0#的(&)乙醇、1*)乙醇效果相当，而(&)乙醇效果略显逊色，但由于*&++,-／./!0#的(&)乙醇需要配制，携带及使用不如1*)乙醇方便。肌肉组织可得到最高质量的!\"#，由于活体采样样品数量不是限制因素，选择保存肌肉组织。比较权衡得出结论，1*)乙醇固定肌肉组织是野外取样的最佳样品保存方法。 为进一步确定1*)乙醇保存的肌肉样品所提取的基因组总!\"#的实验效果，本研究应用所提取的!\"#进行了微卫星指纹图谱分析和线粒体%452\"#、678!和!9-,,:序列分析。结果表明实验效果非常理想。由微卫星指纹图谱和序列分析结果显示，1*)的乙醇保存的样品的实验效果与新鲜材料相比没有差异。 关于样品保存时间对!\"#质量的影响，罗晨 玲等［3*］就不同固定剂及保存温度、时间对小鼠组织!\"#的影响进行了研究，吴晓黎等［% &］ 通过62扩增评估了存放全血温度及时间对提取!\"# 质量的影响。已有的研究证明，不同样品、不同的处理方法，提取的!\"#质量与保存时间的相关性不同。实验中对肝脏和肌肉组织速冻和乙醇固定保存的样品进行对照，常温保存3%个月与保存%周的实验结果相差不大，这证实了乙醇对!\"#没有或仅有较弱的降解作用。但是蛋白质被乙醇固定时间长会造成细胞核难被破裂，核内!\"#离心过程中容易沉淀到管底，魏育红等就此提出了改良方 法［3(］，但是高盐离子浓度会对后续的;62扩增产 生不良影响，所以并不推荐。 通过本研究，我们认为在野外用1*)的乙醇保存小型哺乳动物肌肉样品是一种方便、经济、安全的样品保存方法，该方法保存的样品通过常规方 万 方数据2#;!PF3111MQ3MM!M(F ［Q］张建珍，郭亚平，马恩波F不同保存方式下蝗虫组织!\"# 的提取及2#;!分析［P］F动物学杂志，%&&Q，M1（%）：*M!*(F［*］刘保忠，宋林生，相建海F海湾扇贝样品不同保存条件下!\"# 的提取及2#;!扩增比较［P］F海洋科学，%&&3，%*（M）：*3!*MF［N ］张海琪，薛良义，李明云，等F不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组!\"#提取及2#;!分析［P］F台湾海峡，%&&%，%3（M）：%1N!M&&F［( ］盛岩，郑蔚虹，裴克全，等F微卫星标记在种群生物学研究中的应用［P］F植物生态学报，%&&%，%N（增刊）：331!3%NF［O］胡志昂，王洪新F分子生态学研究进展［P］F生态学报，311O ，3O（N）：*N*!*(QF ［1］P,?4D+R5,,>，!DS@AT2=HH?--FE,-?G=-D56-,J@JUF#.DR,5D8,57 EDJ=D-，M5A?A［E］F6,-A4:5@JUCD5R,5.DR,5D8,57;5?HH，%&&3：QNM!Q(&F ［3&］ED57E;?DG,G>，V?5,J@GD4W@5GB,XXDJA4=HDJPE?5@A?8BFKA?J8@X@GD8@,JDJAGBD5DG8?5@ID8@,J,XJ@J?:,-7+,5: B@G+@G5,HD8?-9-@8?-,G@@J8B?\",58B#+?5@GDJ:@>D，\"#$%&%’()*+’#,-［P］FE,-?9G=>D5/G,-,U7\" ,8?H，%&&%，33（%）：MN&!MN%F［33］#=5?-@,2?7?H，/S@D8D5\"?S,DJA6?G@-@D4DGG,J?F!\"#H?Y =?JG?SD5@D8@,J@J8B?+@8,GB,JA5@D-G,J85,-5?U @,J,XH=R8?55DJ?DJ+,-?5D8H，H:D-DZ?B5?JR?5U@H=:?5H:?G@?H，@JKH5D?-［P］FE,-<@,-/S,-，%&&M，%&（Q）：N%%!NM%F ［3%］6D@Y=DJ[C\\L，WD@7 D[C\\L，DJA4BD,-D@[C#\"]FE,-?G=-D5D=8B?J8@GD8@,J,X8B?DJ@+D-G5=A?A5=UHD@-,JUU =（<,J?,X./%-)(0(1!(+0,/+）［P］F<@,-;BD5+<=--，%&&Q，%(（33）：3O*&!3O*OF ［3M］卢圣栋F现代分子生物学实验技术［E］F北京：中国协和医科 大学出版社，3111：3&3!3&%F［3Q］董明，宫月华，王兰，袁媛F!\"#提取的应用与相关技术分 析［P］F遗传，%&&M，%*（%）：%&*!%&(F［3*］罗晨玲，陈清F 不同固定剂及保存温度、时间对小鼠组织!\"#的影响［P］F生物技术，%&&3，33（M）：QQ!QNF ［3N ］张迎春，刘波，郑哲民，李力F不同保藏处理的昆虫标本!\"#提取及其随机扩增多态!\"#反应［P］F昆虫学报，%&&% ，Q*（*）：N1M!N1*F ［3( ］魏育红，薛仁宇，曹广力，等F乙醇固定中华绒鳌蟹组织的!\"#提取方法［P］F中国水产科学，%&&3，(（Q）：33N!33OF ［3O］李睿，鲁志松，乔琰，等F甲醛对!\"#损伤的彗星实验研究 ［P］F实验生物学报，%&&Q，M(（Q）：%N%!%NOF［31 ］徐来祥，张知彬，宋铭晶，等F福尔马林保存的动物标本基因组!\"#的提取方法［P］F动物学报，%&&%，QO（%）：%NQ!%N1F［%&］吴晓黎，何燕，陈菁，等F存放全血温度及时间对提取!\"# 质量的影响［P］F贵阳医学院学报，%&&&，%*（M）：%M%!%MQF Q(( 3;一种提取动物基因组总DNA的野外样品保存方法 作者：作者单位： 蔡振媛， 张同作， 连新明， 慈海鑫， 苏建平， CAI Zhen-yuan， ZHANG Tong-zuo，LIAN Xin-ming， CI Hai-xin， SU Jian-ping 蔡振媛,连新明,慈海鑫,CAI Zhen-yuan,LIAN Xin-ming,CI Hai-xin(中国科学院西北高原生物研究所,西宁,810008;中国科学院研究生院)， 张同作,苏建平,ZHANG Tong-zuo,SU Jian-ping(中国科学院西北高原生物研究所,西宁,810008)四川动物 SICHUAN JOURNAL OF ZOOLOGY2006，25(3)9次 刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数： 1.张海琪;薛良义;李明云 不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组DNA提取及RAPD分析[期刊论文]-台湾海峡2002(03) 2.刘保忠;宋林生;相建海 海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较[期刊论文]-海洋科学 2001(03)3.张建珍;郭亚平;马恩波 不同保存方式下蝗虫组织DNA的提取及RAPD分析[期刊论文]-动物学杂志 2004(02)4.王义权;周开亚;徐珞珊 不同固定剂保存动物标本对RAPD反应的影响[期刊论文]-动物学杂志 1999(01)5.Joe Sambrook;David W Russell Molecular Cloning.A Laboratory 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