*CN102206697A*
(10)申请公布号 CN 102206697 A(43)申请公布日 2011.10.05
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110093267.6(22)申请日 2011.04.14
(71)申请人郑州安图绿科生物工程有限公司
地址450016 河南省郑州市经济技术开发区
第五大街经北一路87号(72)发明人王则宇 王利英 吴学炜 孙昊权
崔晓晓 孙若楠 郑业焕 杨红云付光宇(74)专利代理机构郑州异开专利事务所(普通
合伙) 41114
代理人王霞(51)Int.Cl.
C12Q 1/34(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 6 页
(54)发明名称
泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基(57)摘要
本发明公开了一种泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，它至少包括己糖胺酶底物、β-D-半乳糖苷酶底物和β-D-葡萄糖苷酶底物三种显色底物。将添加了上述三种显色底物的显色培养基制备成微生物培养基琼脂平板，将样本或经过分离培养的菌落接种到显色平板上，经孵育即可直接观测结果。本发明的显色培养基在一块显色平板上可以同时培养鉴定包括细菌和真菌在内的多种生殖道病原菌，即可以同时鉴定大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌性病原菌以及白色念珠菌、热带念珠菌等真菌性病原菌，肉眼观察即可进行判断，快捷方便，极易操作。CN 102206697 ACN 102206697 ACN 102206701 A
权 利 要 求 书
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1.一种泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：它至少包括己糖胺酶底物、β-D-半乳糖苷酶底物和β-D-葡萄糖苷酶底物三种显色底物。
2.根据权利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：它还包括色氨酸和铁盐。
3.根据权利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：所述显色底物为基于吲哚酚衍生物的底物。
4.根据权利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：所述显色底物的显色基团不同。
5.根据权利要求4所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：当己糖胺酶显色底物的显色基团显现某种颜色时，β-D-半乳糖苷酶底物的显色基团显现与之不同的另一种颜色。
6.根据权利要求4所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，其特征在于：β-D-葡萄糖苷酶底物为显色基团显现不同颜色的两种显色底物。
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说 明 书
泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基
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技术领域
本发明涉及检测病原菌用显色培养基，尤其是涉及一种泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，该显色培养基可同步鉴定多种细菌性、真菌性病原菌。
[0001]
背景技术
泌尿生殖道感染是指病原体直接侵入尿路或生殖道，在尿道或阴道环境中生长繁殖，并侵犯黏膜或组织而引起损伤。
[0003] 引起泌尿生殖道感染的细菌性病原菌主要为革兰氏阴性杆菌，其中以普通大肠埃希氏菌为主，约占50～70%，其它还有克雷伯氏菌、变形杆菌、假单胞菌等，近年来革兰氏阳性菌引起的泌尿生殖道感染呈上升趋势，主要为肠球菌和凝固酶阳性金黄色葡萄球菌，同时凝固酶阴性的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的感染率也呈上升趋势。[0004] 真菌性病原菌如念珠菌引起的霉菌性阴道炎，也称念珠菌性阴道炎，其发病率已高于滴虫性阴道炎，多见于幼女、妇女、糖尿病患者以及绝经后曾用较大剂量雌激素治疗的患者。引起阴道感染的念珠菌80%~90%系白色念珠菌，白带增多的非孕妇女中，约有10%，孕妇中约有30%在阴道中有此菌寄生，当阴道糖原增加、酸度升高时，或在机体抵抗力降低的情况下，便可成为致病的原因，长期应用广谱抗生素和肾上腺皮质激素，可导致念珠菌感染大为增加。
[0005] 现有检测泌尿生殖道病原菌的方法主要有下述几种：I．普通培养法：尿道细菌传统的鉴定方法需要麦康凯和血平板互补培养，初步区分乳糖阳性细菌和乳糖阴性细菌，再根据需要做进一步的生化反应以确定细菌的种类。在鉴定病原菌到属、种时，需要多种生化及其他实验，耗时、费力、程序繁杂。II.分子生物学方法：随着近年来分子生物学的发展，逐渐出现了一些应用PCR检测大肠杆菌、粪肠球菌、白色念珠菌等泌尿生殖道感染菌的方法，PCR法虽然简便快速、灵敏度高，但PCR方法需要昂贵的仪器设备，更重要的是PCR后处理产生污染导致的假阳性问题严重。III．生化方法：无论是生化鉴定仪还是用于鉴别细菌的生化反应管、反应条、反应培养基等，都只能对细菌的纯培养进行鉴定，这就需要首先对标本进行分离培养，整个过程耗时费力、特异性差、灵敏度低，不利于病原菌快速准确的检出。IV．显色培养基培养法：显色培养基由于含有特殊的显色物质，无需通过任何仪器，仅通过肉眼观察菌落的色彩即可对待测标本实现病原菌属间甚至种间的分析；目前可用于泌尿生殖道病原菌检测的显色培养基主要有大肠杆菌显色培养基、ECC显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、UTI定位显色培养基和念珠菌显色培养基等，通过这些显色培养基的应用可以对引起泌尿生殖道感染的大肠杆菌、克雷伯氏菌、肠球菌、白色念珠菌、热带念珠菌等做出初步的分离鉴定，但各有其局限性：
①．大肠杆菌显色培养基：能分离鉴定大肠杆菌，但不能同时分离鉴定肠球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、葡萄球菌等；
能分离鉴定大肠杆菌、克雷伯氏菌，但不能同时分离鉴定肠球菌、②．ECC显色培养基：
念珠菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、葡萄球菌等；
[0002]
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说 明 书
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③．金黄色葡萄球菌显色培养基：能分离鉴定金黄色葡萄球菌，但不能同时分离鉴定大肠杆菌、克雷伯氏菌、念珠菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等；
④．UTI定为显色培养基：能够对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌等做出定位分析，但不能分离鉴定念珠菌等；
⑤．念珠菌显色培养基：能够分离鉴定白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌，但不能用于大肠杆菌、克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、肠球菌。
[0006] 目前临床上对患者标本所作的病原菌培养鉴定以传统方法为主，采取分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，检测周期长，操作繁琐，已经不能满足临床对泌尿生殖道病原菌快速、便利检测的需求，尽管目前市场上存在几种用于尿道细菌和念珠菌检测的显色培养基，如科玛嘉定位显色培养基、梅里埃定位显色培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基等，但这些显色培养基或者仅能用于检测细菌性病原菌，或者仅能用于检测念珠菌，无法满足对引起生殖道感染的细菌性病原菌和念珠菌同时分离鉴定，存在漏检的可能，不利于临床对病原菌的全面判断，从而影响疾病的诊断和治疗。发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，该显色培养基可同时鉴定大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌和克柔氏念珠菌等多种细菌性和真菌性病原菌，方便快捷。
[0008] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的泌尿生殖道病原菌分离鉴定用显色培养基，它至少包括己糖胺酶底物、β-D-半乳糖苷酶底物和β-D-葡萄糖苷酶底物三种显色底物。[0009] 将添加了上述三种显色底物（根据各底物的实际质量，每种显色底物按照0.０３~１g/L的比例添加即可）的显色培养基制备成普通的微生物培养基琼脂平板，将样本或经过分离培养的菌落接种到显色平板上，经孵育直接观测结果；也可以将其固定在一定的载体上（如纸片、纸膜、胶片等，材料可以是棉浆纸、木浆纸、竹浆纸、醋酸纤维膜、聚酯纤维膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚丙烯酸盐、交联纤维素等），制成快速培养检测纸片。[0010] 如果在其中增加色氨酸和铁盐；则添加了色氨酸和铁盐的显色培养基可以同时鉴定奇异变形杆菌。
[0011] 所述显色底物为基于吲哚酚衍生物的底物，也可以是基于硝基苯酚衍生物的底物或基于萘酚衍生物的底物。如果采用产生荧光的显色底物，如采用基于伞形酮衍生物的底物或基于香豆素衍生物的底物，在揭示荧光的情况下，使用本领域技术人员已知的荧光读取设备即可判读出其结果。
[0012] 所述显色底物的显色基团不同。其目的是为了在同一块平板上区分多种病原菌，实现不同病原菌的特异性显色，用同一种显色基团则所有病原菌的显色将呈现同样的颜色，无法达到区分的目的。
[0013] 当己糖胺酶显色底物的显色基团显现某种颜色时，β-D-半乳糖苷酶底物的显色基团显现与之不同的另一种颜色。如β-D-半乳糖苷酶底物的显色基团是显现红色的5-溴-6-氯-3-吲哚基团，而己糖胺酶底物的显色基团则是显现蓝色的5-溴-4-氯-3-吲
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说 明 书
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哚基团；当然也可以是其他颜色的，均可以达到此目的。
[0014] β-D-葡萄糖苷酶底物为显色基团显现不同颜色的两种显色底物。如β-D-葡萄糖苷酶底物就可以用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷两种显色底物。当然也可以是其他颜色的。
[0015] 本发明的优点在于这种显色培养基在一块显色平板上可以同时培养鉴定包括细菌和真菌在内的多种生殖道病原菌，即可以同时鉴定大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌等细菌性病原菌以及白色念珠菌、热带念珠菌等真菌性病原菌，肉眼观察即可进行判断，快捷方便，极易操作。本发明的显色培养基不仅适用于纯培养物的培养鉴定，更可以直接用于临床标本的病原菌培养鉴定，缩短了传统方法中先培养再鉴定的时间，24小时即可判读结果（某些判读不准的情况可以延续培养至48h），更有利于患者的早期诊断和治疗。本发明所述的显色培养基可以用于多种领域，包括医学微生物标本、药品及医疗器械微升检验样品、公共卫生检测样品、化妆品卫生检验样品、食品卫生检验样品等样品中的大肠杆菌、肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌和克柔氏念珠菌的分离鉴定：揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性且半透明的扁平状菌落为大肠杆菌；揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性和β-D-葡萄糖苷酶酶活性同时存在的菌落为肺炎克雷伯氏菌；揭示β-D-葡萄糖苷酶酶活性和己糖胺酶活性同时存在的菌落为肠球菌；揭示己糖胺酶酶活性存在的菌落为白色念珠菌；揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性和己糖胺酶活性同时存在的菌落为热带念珠菌；揭示色氨酸脱氨酶酶活性存在的菌落为奇异变形杆菌；揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性且不透明的圆形突起状菌落为腐生葡萄球菌，产生金黄色色素且不透明的圆形突起状菌落为金黄色葡萄球菌，呈棕褐色的扁平状菌落为铜绿假单胞菌，呈较大的白色且有微毛的菌落为克柔氏念珠菌。
具体实施方式
[0016] 实施例1：使用本发明所述显色培养基分离鉴定泌尿生殖道病原菌
1.1 显色培养基平板的制备：按表1中的配方称取各组分，加纯化水1000ml，调整pH6.8±0.1，115°C，高压灭菌20min，冷却至50°C左右倒平板备用；
表1
成分
大豆蛋白胨酵母浸粉磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）磷酸二氢钾（KH2PO4）丙酮酸钠
N-乙酰-氨基葡萄糖葡萄糖L-色氨酸无水氯化钙硫酸锰硫酸亚铁
5溴-4氯-3吲哚-N-乙酰-氨基葡萄糖苷5溴-6氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷
5
培养基１6.0g3.0g2.5g1.2g3.0g0.4g0.80g0.50g0.05g0.05g0.10.1g0.1g0.07g
来源
北京奥博星OXOID北京益利北京益利北京益利苏州亚科北京益利上海康捷北京益利北京益利北京益利InalcoInalcoInalco
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说 明 书
0.03g
15g
Inalco青岛鲸海
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5溴-4氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷琼脂粉
1.2 微生物菌株的接种将待测菌株制备成悬浊液，并做适当稀释后划线接种于显色培养基平板上，以保证每种菌都以在显色平板上产生分离的单菌落。然后将接种过的显色培养基平板于36±1°C孵育18~24h。在孵育18h~24h后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的着色、生长以及该着色的强度。某些判断不准的情况可以延续培养到48h。[0017] 1.3 结果：培养24h的结果在表2中给出。[0018] 表2
菌株名称大肠杆菌肠球菌
肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌奇异变形杆菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌白色念珠菌热带念珠菌克柔氏念珠菌
菌株编号ATCC25922ATCC29212ATCC700603ATCC27853ATCC49003ATCC29213ATCC12228ATCC49453ATCC10231ATCC750ATCC14243
菌落生长&菌落色泽红色、紫红色墨蓝色
蓝紫到蓝灰色，粘液状褐色到棕色，菌落大而扁平橘黄色到褐黄色、菌落周围有色素扩散，菌落有迁徙现象金黄色、不透明白色，菌落扁平、光滑不透明粉色、不透明天蓝色，菌落光滑不透明浅蓝紫色，菌落光滑不透明白色、菌落扁平模糊、有微毛，菌落较大
表2中所示结果证明，本发明所述的显色培养基，可以同时分离鉴定大肠杆菌、肠球
菌、克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌和克柔氏念珠菌。[0019] 说明：热带念珠菌在培养24h时蓝紫色偏粉紫色，48h后菌落颜色蓝紫偏紫蓝色。[0020] 实施例2：本发明显色培养基营养能力的评价
2.1 显色培养基平板制备：按表3中的配方称取各组分，配制成两种培养基，各加纯化水1000ml，调整pH6.8±0.1，115°C高压灭菌20min，冷却至50°C左右倒平板备用。[0021] 表3
成分
大豆蛋白胨酵母浸粉磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）磷酸二氢钾（KH2PO4）丙酮酸钠葡萄糖
N-乙酰-氨基葡萄糖无水氯化钙硫酸锰硫酸亚铁L-色氨酸
5溴-4氯-3吲哚-N-乙酰-氨基葡萄糖苷5溴-6氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷5溴-4氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷琼脂粉
6
培养基25.0g2.0g2.4g1.1g3.0g0.80g0.40g0.05g0.05g0.1g0.50g0.1g0.1g0.07g0.03g15g
培养基310.0g4.0g2.4g1.1g5.0g0.80g0.40g————0.1g0.50g0.1g0.1g0.07g0.03g15g
来源
北京奥博星OXOID北京益利北京益利北京益利北京益利苏州亚科北京益利北京益利北京益利上海康捷InalcoInalcoInalcoInalco青岛鲸海
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2.2 微生物菌株的接种
将待测菌株制备成悬浊液，并做适当稀释后划线接种于显色培养基平板上，以保证每种菌都以在显色平板上产生分离的单菌落。然后将接种过的显色培养基平板于36±1°C孵育18~24h。在孵育18h~24h后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的着色、生长以及该着色的强度。某些判断不准的情况可以延续培养到48h。[0022] 2.3 结果：培养24h的结果在表4中给出
表4
说明：热带念珠菌在培养24h时蓝紫色偏紫色，48h后菌落颜色蓝紫偏蓝色。[0023] 表4中所示结果表明：在所述营养范围内，均可实现不同病原菌的分离鉴定。[0024] 实施例3：本发明所述显色培养基与科玛嘉定位显色培养基使用对比试验。[0025] 3.1 本发明所述显色培养基平板的制备
于1000ml纯化水中加入大豆蛋白胨9.0g，酵母浸粉4.0g,磷酸氢二钾2.4g，磷酸二氢钾1.1g， 5溴-4氯-3吲哚-N-乙酰-氨基葡萄糖苷0.1g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷0.1g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.07g，5溴-4氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.03g，调整pH6.8±0.1，加入琼脂粉15g后高压灭菌，待冷却至50°C左右倒平板备用；
3.2 按照科玛嘉定位显色培养基配制说明书制备科玛嘉定位显色培养基平板；3.3 微生物菌株的接种
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将待测菌株制备成悬浊液，并做适当稀释后划线接种于显色培养基平板上，以保证每种菌都以在显色平板上产生分离的单菌落。然后将接种过的显色培养基平板于36±1°C孵育18~24h。在孵育18h~24h后肉眼检查形成的菌落。记录这些菌落的着色、生长以及该着色的强度。某些判断不准的情况可以延续培养到48h。[0026] 3.4 结果
培养24h的对比结果在表5中给出表5
菌株名称大肠杆菌粪肠球菌
肺炎克雷伯氏菌铜绿假单胞菌奇异变形杆菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌白色念珠菌热带念珠菌克柔氏念珠菌
本发明所述显示平板红色、紫红色墨蓝色
蓝紫到蓝灰色，粘液状褐色到棕色，菌落大而扁平橘黄色到褐黄色、菌落周围有色素扩散，菌落有迁徙现象金黄色、不透明白色，菌落扁平、光滑不透明粉色、不透明天蓝色，菌落光滑不透明浅蓝紫色，菌落光滑不透明白色、菌落扁平模糊、有微毛，菌落较大
科玛嘉定位显色平板
红色蓝绿色、天蓝色蓝灰色、粘液状白色褐色、带晕轮金黄色、不透明白色、不透明粉色、不透明不生长不生长不生长
从上述结果可以看出本发明的显色培养基不仅可以鉴定出科玛嘉产品所鉴定出的所有细菌性病原菌，还可以从颜色上判断铜绿假单胞菌、白色念珠菌和热带念珠菌，从菌落形态上判断克柔氏念珠菌。
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