广西医学 ２０１５年４月第３７卷第４期 ４５５ 钙调神经磷酸酶抑制剂对ＡＩ３。 所致 阿尔茨海默病大鼠学习记忆及细胞凋亡的影响▲ 王成志石胜良刘倩倩 高怀清 ５３００２１，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｅｙ—ｃｈｅｎｇｚｈｉ＠１２６．ｃｏｍ） （广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁市【摘要】 目的探讨钙调神经磷酸酶抑制剂对Ｂ・淀粉样蛋白（ＡＢ 一 ）所致阿尔茨海默病（ＡＤ）大鼠学习记忆及海马 区细胞凋亡的影响及可能作用机制。方法３６只ＳＤ大鼠随机分为ＡＤ模型组、ＦＫ５０６组及对照组，每组１２只。ＡＤ模型组 和ＦＫ５０６组采用ＡＢ 一 海马注射建立ＡＤ大鼠模型，ＦＫ５０６组以钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司（ＦＫ５０６）干预。用Ｍｏｒｒｉｓ水 迷宫检测大鼠学习记忆能力，原位末端凋亡法（ＴＵＮＥＬ）检测凋亡细胞，实时定量ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）、免疫组化检测海马区促凋亡 蛋白（Ｂａｄ）、细胞凋亡蛋白酶．３（Ｃａｓｐａｓｅ．３）的表达。结果与对照组相比，ＡＤ模型组大鼠学习记忆能力明显减退（Ｐ＜０．０１）， 海马ＣＡ１区神经元细胞凋亡率增高（Ｐ＜０．０５），而ＦＫ５０６可改善ＡＤ大鼠的学习记忆能力，并能减少海马ＣＡ１区神经元细胞 凋亡率（Ｐ＜０．０５）；Ｂａｄ基因转录及其蛋白表达在ＡＤ模型组与ＦＫ５０６组中无明显差异（Ｐ＞０．０５），而ＦＫ５０６可显著减少ＡＤ 大鼠海马区Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达（Ｐ＜０．０５）。结论通过阻断该途径来治疗ＡＤ。 抑制钙调神经磷酸酶激活可改善ＡＤ大鼠的学习记忆能力。ＡＤ的发病机制 可能为，活化的钙调神经磷酸酶可能通过介导Ｂａｄ去磷酸化而激活Ｃａｓｐａｓｅ－３，最终导致细胞凋亡。钙调神经磷酸酶抑制剂可 【关键词】 阿尔茨海默病；钙调神经磷酸酶；细胞凋亡；Ｂａｄ；Ｃａｓｐａｓｅ一３；大鼠 【中图分类号】 Ｒ ７４２ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】０２５３．４３０４（２０１５）０４．０４５５—０４ ＤｏＩ：１０．１１６７５／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３—４３０４．２０１５．０４．０６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｉｚｉｎｇ ｉｎ ＡＩ３１—４２－ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｒａｔｓ ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｉ，Ｓｉｌｌ Ｓｈｅｎｇ—ｌｉａｎｇ，ＬＩＵ Ｑｉａｎ—ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｈｕａｉ—ｑｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎ￣ｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｎ ｈｔｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｉｚｉｎｇ ａｓ ｗｅｌｌ ８８ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＡＢ】一４２－ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＡＤ）ｒａｔｓ ａｎｄ ｉｓｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｉｒｔｙ—ｓｉ】【ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｖｅｄ ｉｎｔｏ ＡＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ＦＫ５０６ ｇｒｏｕｐ ｎｄ ａｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｗｉｔ｝ｌ １２ ｒａｔｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．ＡＤ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａ・ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３１—４２ ｉｎ ｈｅｔ ＡＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＦＫ５０６ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｈｅ ｔｃａｌｃｉｎｅｔｔｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＦＫ５０６）ｗａｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｄ ａｅｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ＦＫ５０６ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｙｔ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｉｚｉｎｇ ｆｏ ｒａｔｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ Ｍｏｒｉｒｓ ｗａｔｅｒ ｎ】日Ｉｚｅ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｎｅ１．１ｌ＇Ｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄ￣ｔｅｄ ｙ ｔｂｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌｂｅａｌｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）．Ｒｅａｌ・ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｂａｄ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｎｄ ｍｅｍｏｒａｉｚｉｎｇ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃｎｔａｌｙ（Ｐ＜０．Ｏ１） ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ ｎｅｕｍＩｌｓ ｉｎ ＣＡ１ ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｈｅ ｔＡＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜０．０５）． ＦＫ５０６ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｉｚｉｎｇ ｉｎ ＡＤ ｒａｔｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ＣＡ１ ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｉｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＡＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＦＫＳ０６ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．ＦＫ５０６ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ （Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｉｒｚｉｎｇ ｏｆ ＡＤ ｒａｔｓ． ＡＤ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｂａｄ・ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｕｒｅ ＡＤ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｉｓ ｐａｔｈｗａｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｂａｄ；Ｃａｓｐａｓｅ一３；Ｒａｔ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种以认 素…。钙调神经磷酸酶（ｅａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ，ＣａＮ）属活性受钙离 知功能减退为主要表现的神经系统退行性疾病，其主要 子／钙调素（Ｃａ２ ／ＣａＭ）调节的丝／苏氨酸蛋白磷酸酶家 的病理学特点是神经原纤维缠结、细胞外淀粉样老年斑 族成员，在大脑皮层、海马神经元中表达最为丰富。研 的形成、神经元细胞凋亡、突触损伤等。而神经元细胞 究发现ＣａＮ抑制剂可逆转ｐ一淀粉样蛋白（ＡＢ 埘）沉积 凋亡是导致神经元丢失及ＡＤ进行性发展的关键因 导致的学习记忆能力减退，减少神经元细胞凋亡 ， ▲基金项目：广西医疗卫生重点科研课题（重２０１２０６６） 作者简介：王成志（１９８７一），男，在读硕士研究生，研究方向：痴呆。 通信作者：石胜良（１９６４～），男，博士后，教授，研究方向：痴呆，Ｅ．ｍａｉｌ：８ｓｌ一１９６４＠１６３．ｃｏｍ。 ４５６ Ｇｕａｎｇｘｉ ＭｅｄｉｃａＺ ＪｏＭｒｎ０ｆ，Ａｐｔ．２０１５，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．４ 但具体机制尚未明了。本实验采用双侧海马注射 各组随机选取６只，依次经心脏灌注生理盐水冲洗和多聚 甲醛固定后取脑，常规石蜡包埋切片。ＴＵＮＥＬ法检测海 马组织细胞调亡，切片脱蜡入水，３％Ｈ２Ｏ 处理１０ ｍｉｎ， ０．０１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）洗３ ｍｉｎ×３次，蛋白酶Ｋ消 Ａｐ ：建立ＡＤ大鼠模型，以ＣａＮ抑制剂他克莫司 （ＦＫ５０６）腹腔注射干预，通过观察大鼠行为学改变及海 马ＣＡ１区神经元细胞凋亡数、促凋亡蛋白Ｂａｄ及细胞凋 亡蛋白酶．３（Ｃａｓｐａｓｅ－３）的表达来探讨ＣａＮ对ＡＤ大鼠 的影响。 化２０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３ ｍｉｎ×３次，滴加ＴＵＮＥＬ反应混合物 ３７￣Ｃ孵育６０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ ｍｉｎ×３次，再加转换剂ＰＯＤ ３７℃孵育３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ ｍｉｎ×３次。ＤＡＢ显色，苏木精 １材料与方法 １．１ 实验动物及材料ＳＤ雄性大鼠３６只，３—４月龄， ２２０～２５０ ｇ（购于广西医科大学动物中心）；ＡＢ 一鸵（美国 Ｓｉｇｍａ公司）；ＦＫ５０６（美国Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ公司）；兔抗大鼠 多克隆抗体Ｂａｄ（美国ＳＡＢ公司）；兔抗大鼠多克隆抗体 Ｃａｓｐａｓｅ－３（美国ＰＴＧ公司）；Ｋｉｔ、ＰＯＤ（瑞士Ｒｏｃｈｅ公 司）；ＳＰ免疫组化试剂盒、ＤＡＢ试剂盒（北京中杉金桥有 限公司）；ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ试剂、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＭＴ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ、ＳＹＢＲ＠Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（日本 Ｔａｋａｒａ公司）；Ｍｏｒｉｒｓ水迷宫系统、大鼠脑立体定位仪 （日本）；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（德国Ｒｏｃｈｅ公司）；Ｏｌｙｍｐｕｓ光 学显微镜系统（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）等。 １．２ 方法 １．２．１模型制备和分组：３６只ＳＤ大鼠随机分为ＡＤ模 型组、ＦＫ５０６组及对照组，每组１２只。ＡＩ３， 溶于 ０．０１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ以稀释成２ ｇ／ ｌ，于３７℃孵育３ ｄ使 其变为聚集态。麻醉大鼠，将其平颅位固定于脑立体定 向仪上。参照包新民 的《大鼠脑立体定位图谱》确定 两侧海马坐标：前囟后３ ｎｌｌｎ，正中矢状缝左右旁开 ２ ｍｍ，硬脑膜下３．５ ｍｍ。按上述位点钻孔，ＡＤ模型组和 ＦＫ５０６组，每侧海马注射５ Ａｐ 一 ，１０ ｍｉｎ内注完，留针 ５ ｍｉｎ以保证Ａｔ３。一 充分弥散。对照组以０．０１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ代替Ｘ１３。一啦注射。术后第２天开始进行药物干预。 对照组和ＡＤ模型组腹腔注射生理盐水（０．２ ｍ＃１００ ｇ）； ＦＫＳ０６组腹腔注射ＦＫ５０６（０．２ ｍｓ／１００ ｇ），隔日１次，共 ３０ ｄ。 １．２．２大鼠行为学观察：药物干预结束后，采用Ｍｏｒｒｉｓ水 迷宫对大鼠进行行为学测试。前５天，每只大鼠每天分别 从４个不同象限入水训练１次，记录大鼠寻找并爬上平台 所需时间，取４次训练的平均值作为每天的逃避潜伏期， 并作为当天的学习能力。规定每次的实验时间为１２０ Ｓ， 若１２０ Ｓ内未找到平台，则帮助其上平台，在平台上站立 １５ Ｓ，拿下休息３０ ｓ后再依象限入水训练。第６天撤去平 台进行空间搜索实验，将大鼠放入平台所在对角线的象限 内，记录２ ｍｉｎ内大鼠穿过隐匿平台次数，以此作为大鼠 记忆能力。 １．２．３原位末端凋亡法（ＴＵＮＥＬ）及免疫组织化学染色： 轻度复然。脱水、透明、封片，显微镜下观察。凋亡细胞的 细胞核为棕黄色（ＴＵＮＥＬ阳性）。随机选取５个不重叠海 马ＣＡ１区４００倍镜视野观察，计数凋亡细胞数和总细胞 数，细胞凋亡率＝凋亡细胞数／总细胞数×１００％。免疫组 织化学染色，取海马冠状层面用ｓＰ法行免疫组织化学染 色，ＤＡＢ显色。Ｂａｄ抗体浓度为１：１００，Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体浓 度为１：１００。阳性表达为胞浆或胞膜染成棕褐色或棕 黄色，阴性对照用ＰＢＳ代替一抗。每个标本取２张切 片，每个切片随机选取３个不重叠的海马ＣＡ１视野区高 倍镜下（×４００）观察，测定每个视野的积分光密度值和 阳性面积，计算其平均积分光密度（ＩＯＤ／ｕｍ ）。 １．２．４ ＲＴ．ＰＣＲ：各组剩余６只，断头取脑，迅速冰上分 离海马，参照ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ试剂说明书提取总ＲＮＡ，反转 录成ｃＤＮＡ（３７℃孵育１５ ｍｉｎ；８５￣Ｃ孵育５ ｓ，４℃终止反 应）后，再进行ＰＣＲ扩增，其中，Ｂａｄ基因：上游引物５ 一 ＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＡＡＣＡＧ一３ ，下游弓ｌ物５ ．ＣＣＴＣ— ＣＴＣＣＡＴＣＣＣｑ３＇ＣＡＴＣＴ－３ ，ＰＣＲ产物：１４３ ｂｐ。Ｃａｓｐａｓｅ－３ 基因：上游引物５ －ＧＧＡＧＣＡＧ１ ＴＩ１’ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴ－３ ，下 游引物５ 一ＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡ ＣＧＧＣＴＩｑ＇Ｃ一３ ，ＰＣＲ产物： １４８ ｂｐ；ＧＡＰＤＨ上游引物：５ ．ＧＧＡＧＡ ｒｒＡＣＴＧＣＣＣＴＧ— ＧＣＴＣＣＴＡ－３ ，下游弓Ｉ物５ ．ＧＡＣＴＣＡＴＣＧ＿ＴＡＣＴＣＣＴＧＣ Ｉ’ｒ－ ＧＣＴＧ．．３，ＰＣＲ产物：１３５ ｂｐ。扩增条件为：９５℃预变性 ３０ Ｓ，然后进入４０循环反应，９５％变性５ Ｓ，５５￣Ｃ退火 ３０ Ｓ，７２￣Ｃ延伸１ ｍｉｎ。表达量的多少通过与内参ＧＡＰＤＨ 比较来反映。 １．３统计学分析采用ＳＰＳＳ １６．０统计软件进行处理。 计量资料以（ ±ｓ）表示，组间比较采用单因素方差分 析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结 果 ２．１ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试结果各组大鼠随着训练天数 的增加，逃避潜伏期均越来越短，说明逃避潜伏期有随 时间变化的趋势（Ｆ时间：２０．２９２，Ｐ＝０．００１），提示各组 大鼠在历次学习训练中均已逐渐学习寻找平台；但时间 与分组的交互作用无统计学意义（Ｆ交互＝０．９１６， Ｐ＝０．５０５）；个体间总体变异部分的结果显示各组大鼠 逃避潜伏期总体而言不同（Ｆ 间＝５．６５４，Ｐ＝０．００８），见 表１。 ４５８ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｆ Ｊｏｕｒｎａｆ，Ａｐｒ．２０１５，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．４ 离子大量流入细胞内并引起１，４，５－三磷酸肌醇（Ｉ ）生 参考文献 成增加，从而激活内质网膜上的兰尼碱受体（ＲｙＲ）和 ＩＰ３受体，导致大量钙离子流入细胞质 。流入的钙离 子与ＣａＮ结合后可激活ＣａＮ，从而启动一系列病理生理 反应，包括神经元细胞凋亡 、微管相关蛋白（ｔａｕ蛋白） 的磷酸化 以及突触的可塑性等 。本实验主要从细 胞凋亡方面来探讨ＣａＮ作用于ＡＤ的可能相关机制。 ［１］Ｙｕａｎ Ｊ，Ｙａｎｋｎｅｒ ＢＡ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７（６ ８０５）：８０２—８０９． ［２］Ｄｉｎｅｔｅｙ ＫＴ，Ｈｏｇａｎ Ｄ，Ｚｈａｎｇ ＷＲ，ｅｔ ａ１．Ａｃｕｔｅ ｉｎｈｉｈｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ Ｔｇ２５７６ ＡＰＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｌｅａｒｎ Ｍｅｍ， ２０Ｏ７，８８（２）：２１７—２２４． ［３］ Ａｌｍｅｉｄａ Ｓ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｌ，ｅｔ ａ１．ＦＫ５０６ ｐｒｅ— 在凋亡发生机制中最关键的影响因素是Ｃａｓｐａｓｅ．３ 和Ｂ淋巴细胞瘤－２（Ｂｃｌ－２）对细胞凋亡的调控。Ｂａｄ是 Ｂｃｌ－２家族的主要促凋亡蛋白，在没有凋亡信号时，处于 磷酸化状态且与１４—３－３蛋白结合 ；当有凋亡刺激时， Ｂａｄ去磷酸化，与１４—３－３蛋白分离，并竞争性结合线粒 体质膜上的异二聚体抗凋亡蛋白Ｂｃｌ—ｘｌ／Ｂａｘ，导致Ｂａｘ 构型改变形成二聚体，最终使线粒体膜上形成一个钙离 子内流和细胞色素Ｃ（Ｃｙｔｏ－Ｃ）外流的交换通道，Ｃｙｔｏ．Ｃ 进入细胞质中激活ＣａｓｐａＬｓｅ一３ ，进而启动一系列的凋 亡过程。 Ｃａｓｐａｓｅ．３是凋亡主要执行者，主要参与凋亡的终末 过程，也是凋亡进入不可逆状态的重要标志。在正常情 况下，Ｃａｓｐａｓｅ．３以无活性的酶原形式存在。当有凋亡信 号刺激时，Ｃａｓｐａｓｅ一３可由无活性的酶原转变为有活性 酶，活化后的Ｃａｓｐａｓｅ－３可裂解细胞膜、抗凋亡蛋白并阻 止损伤ＤＮＡ的修复 等。研究指出，活化的Ｃａｓｐａｓｅ．３ 可以使携带ＡＰＰｓｗｅ的转基因Ｔｇ２５７６ ＡＤ小鼠早期突触 功能障碍 ］、并能切割Ａｐ 、ｔａｕ蛋白 等，切割后的 产物对神经元细胞具有毒性作用，导致神经细胞的凋 亡。 我们的研究结果显示，通过ＣａＮ抑制剂ＦＫ５０６干预 后，大鼠的学习记忆能力明显改善，凋亡细胞数目也明 显下降，说明抑制ＣａＮ激活可在一定程度上缓解ＡＤ症 状，这与Ｃａｒｄｏｓｏ等 的研究结果一致。而通过ＲＴ．ＰＣＲ 及免疫组化技术，我们发现，ＦＫ５０６组与ＡＤ模型组相 比，Ｂａｄ在基因表达水平及蛋白表达水平相差不大，但都 比对照组表达增多；而ＦＫ５０６可显著减少ＡＤ大鼠 Ｃａｓｐａｓｅ ３的表达。因此，我们可以推断，在ＡＤ中，活化 的ＣａＮ可能通过介导Ｂａｄ去磷酸化，而使Ｃａｓｐａｓｅ－３活 化，进而导致神经元细胞凋亡。 本研究结果说明，抑制ＣａＮ激活可能通过影响细胞 凋亡而改善ＡＤ症状，对各组大鼠ＣａＮ活性及其他凋亡 相关因子的检测可能更有助于我们了解其作用于ＡＤ的 机制，从而找到新的神经保护性药物。 ｖｅｎｔｓ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａｌ——ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ・－ ｄｕｃｅｄ ｂｙ ３－ｎｉｔｒｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒａｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｕｌ－ ｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ，２００４，１７（３）：４３５—４４４． ［４］包新民，苏思云．大鼠脑立体定位图谱［Ｍ］．北京：人民 卫生出版社，１９９１． ［５］ Ｗｏｏｄｓ ＮＫ，Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，２０１２，７４０： ｌ １９３—１ ２１７． ［６］ Ｃａｒｄｏｓｏ ＳＭ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＣＲ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ－ ｂｅｔａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００５， １０５０（１—２）：１—７． ［７］Ｑｉａｎ Ｗ，Ｙｉｎ Ｘ，Ｈｕ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａ－ ｔａｓｅ ２Ｂ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓ－ ｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ，２０１１，２３（４）：６１７—６２７． ［８］Ｍｉｉｆａｎｏ—Ｍｏｌｉｎａ ＡＪ，Ｅｓｐａｆｉａ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｅ，ｅｔ １ａ．Ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ・－ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｒｕｐｔ ｎｌｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｉｑｃｋｉｎｇ ｏｆ ａｌｐｈａ－－ ａｌｎｉｎｏ一３－ｈｙｄｒｏｘｙ一５－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｅ－４一ｐｒｏｐｉｏｎｌｅ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ ｅａｒｌｙ ｓｙｎａｐｓｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０１１，２８６（３１）：２７ ３１１—２７ ３２１． ［９］ Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｆｕ Ｈ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇ— ｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ １４－３－３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９９，９６（１５）：８ ５１１—８ ５１５． ［１Ｏ］Ｍｏｒａｉｓ Ｃａｒｄｏｓｏ Ｓ，Ｓｗｅｒｄｌｏｗ ＲＨ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＣＲ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ２５—３５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉａ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００２，９３ １ （２）：１１７—１２５． ［１１］Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ ＮＡ，Ｌａｚｅｂｎｉｋ Ｙ．Ｃａｓｐａｓｅｓ：ｅｎｅｍｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８１（５ ３８１）：１ ３１２—１ ３１６． ［１２］Ｄ Ａｍｅｌｉｏ Ｍ，Ｃａｖａｌｌｕｃｅｉ Ｖ，Ｍｉｄｄｅｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｔｉｒｇ— ｇｅｔｓ ｅａｒｌｙ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉ— ｍｅｔ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１１，１４（１）：６９—７６． ［１３］Ａｙａｌａ－Ｇｒｏｓｓｏ Ｃ，Ｎｇ Ｇ，Ｒｏｙ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃａｓｐａｓｅ—ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ， ２００２，１２（４）：４３０—４４１． ［１４］Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ ＲＡ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ－Ｒｏｂｅｒｓｏｎ ＴＡ，Ｄｏｌａｎ ＰＪ，ｅｔ ａ１． Ｃａｓｐａｓｅ—－ｃｌｅａｖｅｄ ｔａｕ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｒｉｌａ ｄｙｓ－・ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００９，２８４（２８）：１８ ７５４—１８ ７６６． （收稿日期：２０１５—０２—２５修回日期：２０１５—０４—１３）