锦鲤疱疹病毒研究进展

doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2019.08.019

病害与防治

锦鲤疱疹病毒研究进展李潇轩袁朱天袁杨志强袁尹陆乐袁李志辉袁陈建清袁韩飞

渊江苏省淡水水产研究所袁南京

210017冤

锦鲤疱疹病毒病渊KoiHerpesvirusDiease袁KHVD冤袁渊Koi540Herpesvirus,KHV冤所诱发的一种致死率高达80~100%的流行性疾病遥主要感染鲤鱼袁如锦鲤以及其他变异鲤科鱼类遥首次发现于1998年袁由德国和以色列学者从患病的鲤鱼和锦鲤中分离袁并被得到证实的一种病毒遥国内2001年于香港发生首例疱疹病毒爆发事件袁随后在东南亚许多国家的也先后发生过疱疹病毒感染的事例遥世界动物卫生组织渊OIE冤在2006年将KHVD列为强制性疾病遥该文综述了国内外学者对于疱疹病毒最新发现与研究袁以期为后续锦鲤疱疹病毒的研究以及实验设计提供理论依据遥

为疱疹病原科袁鲤疱疹病毒属袁是由锦鲤疱疹病毒

发事件中发现袁锦鲤池塘相比普通鲤鱼池塘更易感染和爆发疱疹病毒遥疱疹病毒潜伏期约为7~15d袁其发病特点是当水温由冬入春或由夏入秋袁当水温上升/下降到15~25益的范围时袁会突然爆发并迅速扩散袁KHVD发病的最佳温度在18~25益这个温度区间袁当水温达到30益以上时发病几率变小袁KHV在鱼体中处于一个潜伏的状态遥研究发现袁KHV已经具备能够在平均温度为3益的冰下繁殖能力[7]遥KHV传染性极强袁且传染方式较多袁且在水中就能

够传播袁通过鱼体排泄出的尿液尧粪便和体液均可迅速传播袁且感染率极高袁潜伏期7~15d袁一旦发病袁死亡率高达80%~100%袁当前从国外引进锦鲤需通过质检中心检疫病毒袁一旦发现病例袁采取联合当地渔政部门组织进行该批次鲤鱼尧锦鲤的全塘灭杀的措施遥1.3

临床表现

1

1998年首次于德国和以色列发现锦鲤疱疹病毒袁该疾病引起了大面积的锦鲤和鲤鱼死亡事件遥我国境内第一例带状疱疹病毒感染事件发生于2001年的香港遥该病在中国广东省于2002年首次被发现[4]遥目前这种疾病已在30多个国家爆发袁尤其是锦鲤养殖大国日本和对锦鲤爱好众多的中国广东境内袁KHV爆发事件每年都会出现袁但分布零星袁在国内很少成片爆发袁是一种全球性的高致死率的鲤鱼传染病遥1.2

流行病学特征

1.1

流行病学特征和临床表现

国内外流行现状

锦鲤疱疹病毒主要集中爆发于春季锦鲤产卵

前袁3要5月袁鲤鱼越冬后水温急剧上升至15~25益的这段时期遥发病前期锦鲤摄食量正常或者有所增加袁发病期仍能摄食袁在民间养殖户称野该吃的吃袁该死的死冶遥锦鲤在感染KHV病毒后病发症状可分为三个时期袁各个时期症状具有一定差异遥病毒感染初期病鱼浮于水面不动或游动缓慢袁部分病鱼体表发黑袁鳞片脱落袁皮下和肌肉出血袁肛门略微红肿曰鳍条尧尾鳍充血袁生病的鱼丝呈暗红色袁减去一个完整的痰液袁血流量比正常鱼慢袁而且容易结痂;肠道红色袁硬而且相当充盈袁肾脏肿胀袁胆汁颜色较深袁颜色为红色袁脾脏有多个出血点遥病毒感染中期

KHVD作为一种流行病症袁感染面十分狭窄袁

目前并未发现有除鲤鱼尧锦鲤和其他鲤鱼变异种外有患染这种疾病的鱼类遥且在有报导的疱疹病毒暴

资助项目院江苏省水产三新工程项目渊D2018-2冤

作者简介院李潇轩渊1982要冤袁男袁高级工程师袁主要从事水产动物遗传育种研究.E-mail院3299811@qq.com

41病害与防治

鱼体游动缓慢袁与进入麻醉状态的鱼体表现相似袁鱼体体色暗淡袁呈灰白色袁中后期表现出花斑袁特别是德国鲤之类的无鳞锦鲤在水中病症尤为明显袁鳞片鱼没有显示明显袁并且帽子和丝绸流血并产生大量粘液遥病毒感染后期袁打捞出水面后病鱼鱼体体色发黑袁双眼严重凹陷袁腮部肿胀发紫红色袁极易出血遥通常患有KHV病毒的病鱼在1~2d内死亡袁病毒感染率高袁病死率高遥且易发生在体态肥硕的锦

2

鲤身上袁对疱疹观赏病鱼锦毒鲤病原体

行业具有严重的打击性遥

2.1

锦鲤毒3型KHVKHV遥经为的过结疱疹分类合病和疱疹毒命名

科病尧鲤毒疱疹发病病症毒状属袁最尧终鲤被疱疹命名病

为锦鲤疱疹病毒渊KHV冤遥KHV形态结构类似于两种不同鱼类的疱疹病毒袁但它在临床表现袁生长特征袁细2.2

胞变KHV异类型分袁感染范围和抗原性方面不同[8]遥较大的KHVpesvirales线冤性为尧尧直子径生物100~110学特性

nm的二十面体袁是一种

鱼类双链螺疱疹DNA旋结病构毒病袁在细科毒渊遥Alloherpesviri属疱疹病毒目渊Her原胞核中具有不原对dae称的冤[4]袁病毒表面具有电子致密区域遥基因组大小为295kb袁内含156个开放阅读框渊ORF冤尧末端8个重复序列遥末端含22个正向重复序列袁GC含量占总核苷酸的59.2豫遥病毒粒子成熟后呈球形袁直径在170~230nm之间遥核衣壳呈二十面体的球状袁直径约110nm遥结构对称袁并且被囊状结构包围遥水温达到15~25益时袁KHV可以存活将近4h袁并且在鱼体的分泌物和塘底淤泥中能够存活更多的时间遥水温和盐碱度是影响病毒的重要因素之一袁在60益的温度条件下持续30min或pH小于3或高于11的条件下袁病毒将会失去感染能力1002.3

可关完遥使于成用KHV对氯仿细菌尧250基的因灭mg/L组活结构遥

的乙醚或1mg/LTritonX-的研究

构尚KHV未确定的主要基袁且对于因编码型已蛋白被鉴的定出功能袁但全尚未基有因明组确结的研究成果遥已经成功克隆出个别较保守且确定功能的2.3.1ORF遥的ORF78蛋白结结构蛋白2010年袁MichelB等人构建出了KHV

ORF65尧尧ORF92构遥KHVORF81冤尧尧ORF99囊的膜蛋白蛋白结构由院核衣壳蛋白渊ORF72尧尧ORF108渊ORF25尧ORF115尧ORF32尧ORF131尧ORF59尧

尧42叶水产养殖曳2019年第8期

ORF132ORF132尧被全冤ORF136和部验22证个尧ORF148遥未构分建类尧KHV蛋白ORF149[5]组冤尧成间遥质但蛋其白渊功ORF62能还未尧能够的主要结构蛋白[7]是细2.3.2胞质中存在ORF25的表达蛋白遥

编码袁参非与病结构毒蛋白的复制非和结基构因蛋白表达是调由控病袁毒但与病基因组毒KHV颗粒互不相容的蛋白质遥根据蛋白质功能的不同袁将瘤坏死的因非子蛋白受结体构冤尧分ORF22类为院ORF2家族尧ORF25家族尧TNFR家族家族和渊Ring肿家族遥ORF2家族包含院ORF2尧ORF9[9]遥TNFR家族包含12院ORF4尧ORF12ORF26冤编码尧具有ORF27TNFR遥尧ORF65基TNFR序的[7]袁蛋白家族ORF148质包遥含6两个基因渊ORF4/和个膜ORF149蛋白院ORF25曰RING尧家ORF150族共征基序遥冤具的有dTTP编码四个是袁组均蛋成含白有渊ORF41尧ORF128尧ORF144尧DNA锌指分结子的基构渊RING本成Finger分袁TK冤特基因的功能是将脱氧胸苷核苷酸催化成dTMP袁然后将dATP其磷态袁以及等酸物质化成dTTP袁间接参与合成dCTP尧dGTP和在一的定过条程件遥诱该导基下因的决爆定发了袁KHV所以学的者潜伏们状普遍认同的观点是KHV毒力来源于TK基因袁对应胸苷ORF56激酶ORF55遥ORF150为RING家族ORF922.4袁为ORF23糖蛋白编码袁膜白蛋白介素-10ORF22遥袁主要衣脂壳蛋蛋白白袁目前传播途径

在感染KHV的病鱼排泄物和体液中均检

测KHV到了粪便之在水KHV中袁中春传的季播病水温袁且毒冬DNA袁所以大多数学者认为升日水温高时开降始低集之中后爆病发毒并潜传伏染在

袁这也是春季疱疹病盛行的因素之一遥但在锦鲤疱疹病毒爆发规模较大的日本袁学者们认为疱疹病毒的传播途径主要是通过鱼类的尿液袁尿液携带病毒进入3共同疱疹水域从而感染其他鱼体由于病KHV毒的具有检潜测伏方期法

遥

长尧传染率高和易感染等

特点袁且由于缺乏对疱疹病毒有效的治疗方案以及传染的预防措施袁所以在国内养殖场或从国外进口锦鲤的检疫隔离期间袁一旦发现KHV的存在立即执行全塘/池灭杀遥随着日本福冈县与江苏省建交25周年袁日方赠予江苏省220条日本锦鲤袁全国规模最大设施最豪华的检验检疫隔离场坐落南京袁打开了一扇新的锦鲤进出口窗口袁再加上近年野锦鲤冶一

叶水产养殖曳2019年第8期

词在网络上的爆红袁进口锦鲤与养殖锦鲤的玩家越来越多袁所以为了降低锦鲤养殖的风险以及爱好者的损失袁该行业迫切的需要一种能够及时发现病毒袁并且耗费成本较低的检测方法袁以降低KHV带来的经济损失遥到目前为止袁通过不断的研究和实验袁研究出了许多锦鲤疱疹病毒的检测方法院细胞分3.1

离培细养胞试验分离袁培养血清技术

中和试验和分子生物学试验[22]遥3.1.1改进袁使环用环介导介等温导等温扩增渊扩LAMP增渊LAMP冤通冤法过测不定断研究锦鲤和疱疹病毒的特异性和敏感度越来越高遥Wen-HSin等

建立了一个在集成微流体系袁运用LAMP方法分离病原[27]袁仅使用90min袁便可完成对4种病原的检测袁而PCR技术需要较长的检测时间才能得出准确结果袁LAMP也能得出相对准确的结果遥因此,随着KHV科学研究的发展袁LAMP极有可能成为快速检测

3.1.2的主前被广分泛子流用生物方法遥

于检学测诊KHV断方的方法渊PCR法袁冤检PCR测方技术是法相对当具体和敏感袁可以取鱼体鳃部样本进行初级检测袁但是要进行完整检测需取6处不同的样本袁但此方法涉及鱼体的肾尧脏袁所以仅适用于死鱼检测遥在国外私营性质的工作室会采用PCR技术进行取腮样本的初步试验袁来降低出口锦鲤携带KHV的可能性袁但3.1.3

不进行KHV其他完整检检测测方仍法

然无法除了规上避述这两一种常风险见遥的检测

和原位的方杂交法技术等外袁国内检测还方有法ELISA遥但是尧电ELISA子显微法镜花技术费较大袁而且与CCV和CHV会发生交叉免疫反应袁因此有学者认为它不适合日常检测和推广遥电子显微技

术和原位杂交技术所需要的设备费用十分昂贵袁更

4

不利锦于日常鲤疱疹检测病和毒推防广控遥

措施

爆发KHVD将带给具有高鲤鱼尧锦传鲤染养殖性和户高及感锦染鲤性的爱好者特征巨袁一大的旦经济损失袁及时检测和进行防控有助于降低这一损失4.1

遥目前免疫预防防

制KHV的最有效方法是使用疫苗免疫袁减毒疫苗已经由开发商投入并在一些规模较大的渔场投入使用遥减毒疫苗对鱼的免疫保护的效应期可达8个月以上袁但目前在对行业中已经开始投

病害与防治

入使用的研究中发现袁并不能够对该病情的控制和病毒免疫产生理想的效果遥目前袁该疫苗证明对疱疹病毒的的有效处理方式是配合疫苗通过变温或在细胞上连续传代获得突变株袁效应期间袁通过试验减毒疫苗免疫的锦鲤和鲤鱼免疫保护率在理论上可达到80%以上遥减毒疫苗可以有效地刺激鱼的细胞免疫功能袁并且延长细胞的免疫时间袁具有广泛的特异性袁但是减毒疫苗可能会发生病毒变异和毒4.2

散袁造成一定的负面影响遥部其他分研究防治[27]措相施

信袁KHVD的流行性根本原因在于水温的季节性变化袁并认为控制水温即可控制病毒爆发遥但是最新研究发现即便在冰下袁KHV仍然能够繁殖袁所以控制温度并不能在根本上解决病毒爆发的问题遥部分锦鲤研究者想通过筛选具有抗病性的锦鲤家系来减少锦鲤疱疹病毒带来的危害袁但是目前筛选效果不理想且并未出现对于锦鲤疱疹病5

毒锦产鲤生抗疱疹体的病锦毒鲤的品发展系遥

前景

影响KHVD袁国内目前自发现还没以研究来对出锦能鲤够行防业治产KHVD生了巨的有大的效措施袁且缺乏有效的防控手段袁所以一旦检测发现携带锦鲤疱疹病毒的病鱼需立即执行同一水域的全塘灭杀袁这种直接的处理方式对锦鲤爱好者及鲤鱼尧锦鲤养殖户会带来十分惨重的损失遥随着观赏鱼行业的开拓和锦鲤受众者的增多袁防治疱疹病毒研究的步伐也在不断加快遥KHV从出现到开始在全球呈流行性爆发已经持续了二十多年之久袁但由于其宿主范围十分狭窄且病毒结构十分复杂袁国内对于疱疹病毒的研究仍旧比较稀缺遥在锦鲤养殖规模最大的日本袁许多学者认为疱疹病毒的爆发并非是一种自发性的爆发袁而是受水温以及环境因素的诱20导而形年间成袁并爆未发的一种病毒曰而且在病毒出现长达的

通过筛选优良有家系能够来产对生抗抗体KHV的锦的鲤显家系得十出分现困难袁所以袁且针对疱疹病毒的疫苗虽然能够在理论上达到防

治KHV的效果袁但在实际使用中的效果并不理想遥

近年锦鲤已经重新获得了进出口的允许袁为规避从外来的鲤科鱼类尧特别是锦鲤体内携带疱疹病毒进入内地的可能性袁中国海关要求进口锦鲤需要在隔离场内进行为期一个月的隔离袁并在当地质检中心对进境锦鲤进行两次的抽样调查检测袁保证对43病害与防治

外来病毒的入侵的严格把控遥但国内还存在不少携带锦鲤疱疹病毒的病鱼袁如何有效地治疗已经感染的病鱼及防止与其共用同一水体健康鱼体感染疱疹病毒显得尤为重要袁研究开发真正能够用于生产上的基因疫苗袁防止病毒扩散袁并控制KHV的全球性暴发袁从而减少养殖户和观赏鱼玩家的经济损失袁确保锦鲤和鲤鱼养殖业乃至休闲渔业的健康发展遥

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叶水产养殖曳2019年第8期

doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2019.08.020

病害与防治

一种中华绒螯蟹病原要要要腐败希瓦氏菌尹晓静袁周静华袁王杰

渊苏州市相城区水产技术推广站袁江苏

苏州

215131冤

中华绒螯蟹是苏州地区的主要水产养殖品种之一遥在养殖过程中袁部分养殖户塘口的中华绒螯蟹出现了活力下降甚至死亡的情况袁造成了较大的损失遥从患病蟹体内分离到腐败希瓦氏菌渊She原

wanellaputrefaciens冤并人工回感成功袁该文有关腐败希瓦氏菌及其药物敏感性的结果有助于对中华绒螯蟹的细菌性疾病进行预防和治疗遥

次TSA平板划线袁直至获得细菌纯培养物遥再取单个菌落分别划线于MCKA平板和RSA平板袁28益恒温培养箱中培养24h袁观察菌落生长情况遥1.4细菌鉴定

1

1.1

材料与方法

中华绒螯蟹

1.4.1生化鉴定将分离菌纯培养物划线MCKA平板袁28益恒温培养箱中培养20~24h袁挑取菌苔至0.85%NaCl生理盐水中袁用比浊仪配制成0.5麦氏浓度菌液袁菌液接入E/NF生化鉴定板条袁28益恒温培养箱中培养20h袁板条通过BBLCrystl微生物鉴定系统进行鉴定分析遥1.4.21.5

60耀80g袁病蟹十肢无力袁行动迟缓袁血液凝固慢或不凝遥人工回感试验所用健康蟹购自阳澄湖镇养殖池塘袁平均体质量62g/只遥1.2主要试剂和仪器

患病蟹来自相城区阳澄湖镇的发病蟹塘袁规格

PCR扩增与测序分离菌株16SrDNA的

PCR扩增与序列分析委托苏州泓迅生物科技有限公司完成遥

人工感染

胰蛋白胨大豆琼脂渊TSA冤尧麦康凯琼脂渊MCK原A冤尧RS琼脂渊RSA冤渊北京陆桥技术有限责任公司冤曰药敏板渊南京菲恩医疗科技有限公司冤曰E/NF生化鉴DickinsonandCompany,USA冤遥1.3细菌分离

定板条尧BBLCrystl微生物鉴定系统尧比浊仪渊Becton,

健康蟹分放在5个中转箱渊长伊宽伊高=60cm伊

40cm伊30cm袁水深10cm冤中袁充氧袁不投饵袁室温空调维持27~28益袁暂养3d袁弃去伤残体弱袁开始试验遥设4个试验组袁每组10只蟹遥采用肌肉注射法袁每组注射分离菌液浓度分别为2伊108尧1伊108尧0.5伊108尧0.25伊108CFU/mL袁每只0.1mL遥同时设一对照录蟹发病死亡情况遥对刚死的蟹立即进行细菌分离袁如果重新分离到接种菌株且为优势菌株袁即可以确定蟹发病死亡是由该菌株造成遥采用改良寇氏

将病蟹在自来水中洗刷外壳袁并用干净纱布吸

组袁注射同等量无菌生理盐水袁48h后观察结果并记

TSA平板上划线分离袁28益恒温培养箱中培养24h袁从平板上形态一致的优势菌落中选取单个菌落袁再

干表面水分袁然后以无菌操作打开外壳袁取肝脏在

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渊收稿日期院2019-01-21冤45