生 ＬＥＴＦＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥ。ＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏ１．２２ Ｎｏ．５ Ｓｅｐ． ２０１ １ 物 技 术 通 讯 ６８３ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１ １．０５．０１９ 研究报告 ｅ 猪内源性反转录病毒囊膜基因 真核表达质粒的 构建及鉴定 叶小丽 ，吕茂民 ，颜奇坡 ，郭逸 ，吴健敏 ，田克恭。，马玉媛 ，章金刚 １．军事医学科学院野战输血研究所，国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室，北京１００８５０； ２．广西兽医研究所，广西南宁５３０００１；３．中国动物疫病预防控制中心，北京１０００９４ ［摘要］ 目的：构建猪内源性反转录病毒（ＰＥＲＶ）囊膜基因ｅｎｕ的真核表达质粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ并加以鉴定，为研究 ＰＥＲＶ的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法：用ＲＴ—ＰＣＲ方法扩增五指山猪来源ＰＥＲＶ的ｅｎｖ基因，将其插入 ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ载体中，构建重组质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—ｅｎｖ，酶切鉴定正确后，将ｐＧＥＭ—Ｔ—ｅｎｖ与ｐＨＣＭＶ—ＶＳＶ—Ｇ表达质粒 同时经ＥｃｏＲ Ｉ酶切消化后连接，构建重组表达质粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ，并进行酶切、测序鉴定；将鉴定正确的质粒 ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，采用ＰＣＲ、ＲＴ—ＰＣＲ检测转染后ｅｎｖ基因的整合和转录情况。结果：扩增得到五指 山猪来源ＰＥＲＶ的ｅｎｖ基因，并构建了ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ真核表达质粒，转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞系后，该细胞系中有目的基 因的整合和转录。结论：构建了真核表达质粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ，并且在ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中能够整合并转录，为研究ＰＥＲＶ 的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。 ［关键词］ 猪内源性反转录病毒；ｅｎｖ基因；真核表达 ［中图分类号］Ｑ７８ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１１）０５—０６８３—０４ Ｃ０ｎｓｔｒｕｃｔｉ０ｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｅｎｐ Ｇｅｎｅ ＹＥ Ｘｉａｏ—Ｌｉ ，Ｌｔ）Ｍａｏ—Ｍｉｎ ，ＹＡＮ Ｑｉ—Ｐｏ ，ＧＵＯ Ｙｉ ， Ｕ Ｊｉａｎ－Ｍｉｎ２，ＴＩＡＮ Ｋｅ－Ｇｏｎｇｚ，ＭＡ Ｙｕ－Ｙｕａｎ ．ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎ－Ｇａｎｇ￣ １．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＮＣＢＡ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５０；２．Ｇｕａｎｇｘｉ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００１；３．Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎ— ｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４；Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｕｓｒ （ＰＥＲＶ）ｅｎｖ ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｅｎｖ ｇｅｎｅ ｏｆ ＰＥＲＶ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｗｕｚｈｉｓｈａｎ ｍｉｎｉａｔｕｅｒ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｒｅｃｏｍ— ｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＭ—Ｔ—ｅｎｖ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＣＭＶ—ＶＳＶ—Ｇ ａｎｄ ｐＧＥＭ—Ｔ－ｅｎｖ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥｃｏＲ Ｉ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉ— ｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ。ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＨＥＫ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｌｅ ｉｔｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ— ｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ＆Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＣＭＶ－ｅｎｖ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＨＥＫ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎ－ ｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ＰＥＲＶ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｕｓ；ｅｎｖｒ ｇｅｕｅ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 近年来在器官移植方面，猪一人器官异种移植 为穿膜蛋白（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ＴＭ）；较大的通过二硫 键和氢键与ＴＭ相连，暴露于囊膜表面，称为表面蛋 ［收稿日期］２０１１－０２—１７ ［基金项目］国家自然科学基金（３０７７１６１０，３０８００８２９） ［作者简介］叶小丽（１９８６一），女，硕士研究生 ［通信作者］马玉媛，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｍａｙｕｙｕａｎＯ７＠ｌ６３．ｃｏｍ； 章金冈０，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｚｈａｎｇｊｇ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｅ．ｅｎ 的病原安全性引起了人们的广泛关注，其中，猪内 源性反转录病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ， ＰＥＲＶ）对异种移植的潜在威胁，更是医学研究的热 点ｌ】 。ＰＥＲＶ的ｅｎＶ基因编码病毒的囊膜蛋白，该囊 膜蛋白由２条肽链组成：较小的贯穿病毒囊膜，称 生 物 技 术通 讯ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣ ＮＯＬＯＧＹ Ｖｏ１．Ｈ －－１． ２—２一一Ｎｏ．． ５一ｂ～ｅｐ．．，２， —０—１１ Ｈ白（ｓｕｒｆａｃｅ ｕｎｉｔ，ＳＵ）。研究表明，ｅｎｖ基因与ＰＥＲＶ 的宿主范围、细胞嗜性、诱导宿主产生中和抗体等 密切相关［３１。目前，国内还没有对中国特有小型猪来 源ＰＥＲＶ的宿主嗜性进行研究的相关报道。因此，构 Ｆ１／Ｒ１各２０ ｐｍｏｌ，Ｐｈｕｓｉｏｎ超保真酶０．４ Ｕ，加无菌 去离子水补至２０ Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９８ ４ ｒａｉｎ， 然后以９８℃４０ Ｓ、５６ ９０ Ｓ、７２℃９０ Ｓ进行３０个 循环，７２￣Ｃ延伸１０ ｒａｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶 电泳分析并纯化回收。按照载体ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ 建ｅｎｖ基因真核表达质粒，对研究ＰＥＲＶ的感染机 制，确定其最易感细胞，进而分析其细胞嗜性范围 是很有意义的。 ｖｅｃｔｏｒ试剂盒说明书，将回收产物和ｐＧＥＭ—Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ进行连接，连接产物转化感受态ＤＨ５ａ，经蓝 本实验室已完成了对中国特有小型猪基因组 白斑筛选，挑选单个白色克隆进行扩大培养后抽提 中ＰＥＲＶ存在的检测及亚型分析［４１，并对其囊膜基 因进行了克隆及进化分析［５３、蛋白二级结构和Ｂ细 胞表位预测等相关研究［６１。在前期工作的基础上，我 们拟通过构建ＰＥＲＶ囊膜基因ｅｎｖ真核表达质粒， 配合反转录病毒载体及辅助质粒，包装产生以 ＰＥＲＶ—Ｅｎｖ为囊膜的假型病毒粒子，从而为进一步 确定ＰＥＲＶ细胞感染谱打下基础。 １材料与方法 １．１ 材料 五指山猪外周静脉血（ＥＤＴＡ—Ｋ 抗凝）来源于 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所；感受态大肠 杆菌ＤＨ５ａ和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞均由本实验室保存； 真核表达质粒ｐＨＣＭＶ—ＶＳＶ—Ｇ由本所王韫芳博士 赠送；载体ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公司； ＤＮＡ聚合酶、Ｐｈｕｓｉｏｎ超保真酶、性内切 酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶和ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００等购自 ＮＥＢ公司；ｄＮＴＰ、质粒小量提取试剂盒、ＤＮＡ凝胶 回收试剂盒和Ｍ—ＭＬＶ反转录试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ 公司；ＴＲＩｚｏｌ试剂、ＲＰＭＩＩ６４０细胞培养基和Ｌｉｐｏ． ｆｅｅｔＡＭＩＮＥ ２０００试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司； 纤维素膜（ＮＣ，ｑｏ７７ ｍｍ，孔径０．４５、０．２２ Ｉｘｍ）购自 Ｐａｌｌ公司；ＤＭＥＭ／Ｆ１２细胞培养基、胎牛血清和小牛 血清购自ＧＩＢＣＯ公司。 １．２ 引物设计和ｅ／ｚｐ基因的扩增、克隆及鉴定 根据ＧｅｎＢａｎｋ中五指山猪ＰＥＲＶ序列（登录 号：ＥＦ１３３９６０）设计上游引物Ｆ１（５ 一ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣ ＡＴＣＣＣＡＣＧ ｒｒＡ一３ ，６１７１￣６１８５ ｂｐ，下划线部分为 Ｋｏｚａｋ序列）、下游引物Ｒｌ（５ｒ＿ＧＧＴＴＧＣＡ唧ＣＡＴ ＣＣ１ｒ］ ＣＡＴｒＣＣ一３ ，８１９７－８２２３ ｂｐ），用于扩增 ＰＥＲＶ—ｅｎｖ全长序列。采用淋巴细胞分离液分离五 指山猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），用ＴＲＩｚｏｌ试剂 制备ＰＢＭＣ总ＲＮＡ并反转录合成ｃＤＮＡ第一链。 以Ｆ１／Ｒ１为引物、以ｃＤＮＡ第一链为模板扩增ｅｎｖ 基因。ＰＣＲ反应体系包括ｃＤＮＡ ｌ Ｌ，５ｘＨＦ缓冲 液４ Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混合物０．４ Ｌ，引物 质粒，进行Ｈｉｎｄｍ双酶切鉴定。 １．３表达质粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ的构建及鉴定 酶切鉴定正确的ｐＧＥＭ—Ｔ—ｅｎｖ和ｐＨＣＭＶ— ＶＳＶ—Ｇ质粒同时经ＥｃｏＲ Ｉ酶切消化，ｐＨＣＭＶ载体 片段去磷酸化后与ｅｌｚｙ片段连接，构建重组表达质 粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ，连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞。 ＥｃｏＲ Ｉ双酶切鉴定重组质粒，鉴定正确的质粒由中 美泰和生物技术有限责任公司测序。 １．４细胞培养及转染 常规方法培养ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，至对数生长期 时接种到底面直径１０ ＣｌＴＩ的细胞培养皿中，调整细 胞密度为６ｘ１０６／皿，在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ 中，于３７ｏＣ、５％ＣＯ：培养箱中培养１８－２４ ｈ，待细 胞生长达６０％－８０％汇合度时弃去培养液，用无血清 培养基洗涤细胞２次，按照ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００试 剂盒说明书，将上述鉴定正确的重组表达质粒 ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ和空载体ｐＨＣＭＶ分别转染ＨＥＫ２９３Ｔ 细胞。 １．５ 转染细胞基因组中ｅｎｖ基因整合及转录情况 的检测 提取转染后ＨＥＫ２９３Ｔ细胞基因组ＤＮＡ和总 ＲＮＡ，并按Ｍ—ＭＬＶ反转录试剂盒说明书将总ＲＮＡ 反转录合成ｅＤＮＡ第一链，分别以基因组ＤＮＡ和合 成的ｃＤＮＡ为模板，用检测引物Ｆ２（５＂－ＧＣＴＡＣＣＴＣ １ＴｒＣ１ＴｒＧ１ＴｒＧＧＣＴＡＴＧＣ一３ ，７１３４－７１５７ ｂｐ）、Ｒ２（５ 一 ＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡ Ｉ１ＡＡＣＣＡＧＧＴＡＣＣ一３ ．７３７６～７３９９ ｂｐ）检测ｅｎｖ基因在ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中的整合和转录 情况。ＰＣＲ反应体系包括模板ＤＮＡ／ｃＤＮＡ ２ ＩｘＬ， １０ｘＰＣＲ缓冲液２ Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混合物２ ＩｘＬ，Ｆ２／Ｒ２各２０ ｐｍｏｌ，ｒａｑ ＤＮＡ聚合酶１．５ Ｕ，加 无菌去离子水至２０ Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性 ５ ｒａｉｎ，然后以９４℃３０ Ｓ、５８ｏＣ ４５ Ｓ、７２ｏＣ ３０ Ｓ进 行３０个循环，７２℃延伸５ ｍｉｎ。以转染空载体 ｐＨＣＭＶ的ＨＥＫ２９３Ｔ细胞和正常ＨＥＫ２９３Ｔ细胞的 基因组ＤＮＡ和ｅＤＮＡ作为阴性对照。 ６８６ 通讯生技术ＴＴＥＲ ＬＥＴＴ Ｓ ＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏ１…． ２…２ Ｎｔｏ．．５ ｂ） —ｅｐ．．，２， …０１１一 ＰＥＲＶ属反转录病毒科／正反转录病毒亚科 反转录病毒属。根据ｅｎｖ基因的不同，可将ＰＥＲＶ分 为３种不同的亚型，即ＰＥＲＶ－Ａ、ＰＥＲＶ－Ｂ和 ＰＥＲＶ—Ｃｌｌ１１。ＰＥＲＶ—Ａ和ＰＥＲＶ—Ｂ的宿主范围较宽， 能感染多种人源细胞系、猪细胞系和其他一些物 ［２］Ｌｏｕｚ Ｄ， Ｂｅｒｇｍａｎｓ Ｈ Ｅ，Ｌｏｏｓ Ｂ Ｐ， ｅｔ ａ１． Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｒｉｓｋｓ ｐｏｓｅｄ ｂｙ ＰＥＲＶｓ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，２００８，１８（１）：５３－６５． ［３】Ｋｕｄｄｕｓ Ｒ Ｈ，Ｇａｎｄｈｉ Ｃ Ｒ，Ｒｅｈｍａｎ Ｋ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂｅｔａ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｓｅｐｑｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５（６）：２７６５—２７７０． 种，而ＰＥＲＶ—Ｃ仅能感染１种人源细胞系和２种猪 细胞系＿ｌ２１。据文献报道，影响ＰＥＲＶ宿主嗜性的区域 ［４】Ｍａ Ｙ Ｙ，Ｌｖ Ｍ Ｍ，Ｘｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｗｕｚｈｉｓｈａｎ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇｓ ｉｎｂｒｅｄ［Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒａｔ ｈｎｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏ・ 主要存在于表面蛋白的Ａ多变区（ＶＲＡ）、Ｂ多变区 （ＶＲＢ）和脯氨酸富集区（ＰＲＲ）ｔ”～４１。 以往的研究表明，中国特有小型猪ＰＥＲＶ的 ｅｎｖ序列与其他ＰＥＲＶ的ｅｎｖ序列存在差异［１４，进一 步分析发现差异主要集中于ＳＵ的ＶＲＡ、ＶＲＢ和 ＰＲＲ区。因此，中国特有五指山猪来源ＰＥＲＶ的宿 主范围可能与国外来源ＰＥＲＶ的宿主范围也存在差 异。在本实验中，我们从中国特有五指山小型猪外 周血淋巴细胞中扩增得到ＰＥＲＶ的ｅｎｖ基因，经克 隆、鉴定后替换真核表达质粒ｐＨＣＭＶ—ＶＳＶ—Ｇ中的 ＶＳＶ基因，构建得到ＰＥＲＶ ｅｎｙ基因的真核表达质 粒ｐＨＣＭＶ—ｅｎｖ。该真核表达质粒能整合入 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞并转录，用其包装携带ＰＥＲＶ囊膜的 假型病毒粒子，解决了目前ＰＥＲＶ分离纯化技术不 成熟，不便于进一步研究ＰＥＲＶ与宿主细胞表面受 体的相互作用和ＰＥＲＶ的细胞嗜性的问题。 用该真核表达质粒包装的假型病毒粒子，具有 与中国特有五指山猪来源ＰＥＲＶ相同的宿主嗜性范 围，可以用其感染多种动物细胞，研究ＰＥＲＶ的细胞 感染谱，为进一步确定稳定易感的细胞株，进而构 建ＰＥＲＶ的体外细胞感染模型和体内安全性评价系 统打下了基础。 参考文献 ［１】Ｌｅｙｈ Ｒ Ｇ，Ｗｉｌｈｅｌｍｉ Ｍ，Ｗａｌｌｅｓ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｈｅａｒｔ ｖａｌｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｒｓｋ ｏｆ ｃｒｏｓｓ——ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏ－ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ，２００３，１２６（４）：１０００—１００４． ｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２０１０，３３：３２３－３３１． ［５】 吕茂民，贾莉纬，赵宝全，等．中国实验小型猪内源性反转录 病毒囊膜糖蛋白基因的克隆与序列分析［Ｊ１． 中国预防兽医学 报，２００２，２４（增刊）：１４３—１４６． ［６］吴健敏，吕茂民，陈凤莲，等．中国特有小型猪内源性反转录 病毒囊膜糖蛋白基因的克隆及进化分析［Ｊ］． 中国人兽共患病 学报，２００６，２２（１０）：９２５—９２８． （７］Ａｌｌａｎ Ｊ Ｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ ａｔ ａ ｃｒｏｓｓ—ｒｏａｄｓ：ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｖｅｒ— ＳＵＳ ｐｒｏｇｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９６，２（１）：１８－２１． ［８］Ｌｕ Ｍ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｇ，Ｊｉｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｕｓ ｉｎ ｆｏｕｒ ｐｉｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｊ Ｖｅｔ ｓｃｉ，２００３，２３（１）：１－３． ［９】Ｐａｔｉｅｎｃｅ Ｃ，Ｔａｋｅｕｅｈｉ Ｙ，Ｗｅｉｓｓ Ｒ Ａ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｂｙ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｕｒｓ ｏｆ ｐｉｇ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１ ９９７，３（３）：２８２－ ２８６． 【１０］Ｅｒｉｃｓｓｏｎ Ｔ，Ｏｌｄｍｉｘｏｎ Ｂ，Ｂｌｏｍｂｅｒｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂｅｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５（６）：２７６５—２７７０． ［１ １】Ｃｈｅｎ Ｙ Ｃ，Ｙｕｎ Ｒ Ｐ，Ｈｗａｎ Ｙ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｎｐｅｓ ｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ［Ｊ１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，３６１：３６４— ３７１． ［１２］Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ，Ｐａｔｉｅｎｃｅ Ｃ，Ｍａｇｒｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ— ｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｉｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８，７２（１２）：９９８６—９９９１． ［１３】Ｗａｔａｎａｂｅ Ｒ，Ｍｉｙａｚａｗａ Ｔ，Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏ— ｖｉｕｒｓｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｃｔ，２００５，７（４）：６５８－６６５． ［１４］Ａｒｇａｗ Ｔ，Ｆｉｇｕｅｒｏａ Ｍ，Ｓａｌｏｍｏｎ Ｄ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ【ＪＩＪ ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００８，８２（１５）：７４８３—７４９１．
