(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112195222 A(43)申请公布日 2021.01.08
(21)申请号 202011061975.7(22)申请日 2020.09.30
(71)申请人 北京农业信息技术研究中心
地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路
11号农科大厦A座1107(72)发明人 董宏图 张晗 罗斌 王成
王晓冬 李爱学 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 陈征(51)Int.Cl.
C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法(57)摘要
本发明涉及一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法。柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：提供系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌DNA；对所述DNA进行琼脂糖凝胶电泳；对所得电泳条带进行分析，得到对应的条带亮度值；构建所述DNA的浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线；提供待测样品的DNA和柑橘黄龙病病菌的特异性扩增引物，进行PCR扩增；对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对所得电泳条带进行分析，得到待测样品的条带亮度值；根据所述标准曲线获得待测样品的DNA浓度。本发明检测方法可以实现对未知病菌浓度的植物组织中病菌含量定量检测，结果准确，操作方便。
C12R 1/01(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页
序列表2页 附图2页
CN 112195222 ACN 112195222 A
权 利 要 求 书
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1.一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：提供系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌DNA；对所述DNA进行琼脂糖凝胶电泳；对所得电泳条带进行分析，得到对应的条带亮度值；构建所述DNA的浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线；提供待测样品的DNA和柑橘黄龙病病菌的特异性扩增引物，进行PCR扩增；对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对所得电泳条带进行分析，得到待测样品的条带亮度值；根据所述标准曲线获得待测样品的DNA浓度。
2.根据权利要求1所述柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，其中，所述柑橘黄龙病病菌为韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)。
3.根据权利要求1或2所述柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，其中，所用的特异性扩增引物为：
Hlbsf 5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGAHlbsr 5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT。
4.根据权利要求1-3任一项所述柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：1)取感染柑橘黄龙病的植物叶片，磨碎，用试剂盒进行DNA提取，得到DNA样品；以已提取的DNA为扩增模板，采用上述特异性扩增引物Hlbsf/Hlbsr，进行PCR扩增反应；
扩增反应结束后，取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收纯化；对胶回收产物进行DNA浓度测量，将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液；分别以浓度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的DNA为模板，采用上述特异性扩增引物Hlbsf/Hlbsr，进行PCR扩增；
PCR扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用image J软件对扩增条带进行分析，得到每个条带亮度对应的数值，以模板浓度为横坐标、亮度值为纵坐标，构建标准曲线；
2)另取待测样品的柑橘黄龙病菌DNA，按照上述程序进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、扩增条带亮度分析，获得条带亮度值，根据所述标准曲线获得待测样品的DNA浓度。
5.用于柑橘黄龙病病菌快速检测的引物，所述引物为：Hlbsf 5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGAHlbsr 5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT。
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说 明 书
一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法
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技术领域
[0001]本发明涉及一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法。
背景技术
[0002]柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生产上危害最严重和最具破坏性的毁灭性病害。黄龙病被认为是由一种专生于柑橘韧皮部组织的细菌引起。其传播途径包括嫁接和柑橘木虱传播。目前所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都受到黄龙病病菌的浸染。感病后的植株不仅不能产生经济价值，且易感程度高的品种如脐橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡，尚无黄龙病治疗康复的相关报道。因此对于黄龙病病菌的快速、准确和定量检测，对于黄龙病的防控和研究具有重要的意义。[0003]目前针对柑橘黄龙病病菌检测方法主要包括田间诊断、血清学诊断等，随着分子生物学检测方法广为流行，最常用的是基于普通PCR技术的检测方法，这种方法操作简单快捷，可以准确的鉴定出植株是否携带黄龙病病菌，但仅限于进行定性检测，不能对植株体内含菌量进行定量评估。因此如何对柑橘属植物体内黄龙病病菌含量进行评估，对于田间及实验室研究具有重要作用。
发明内容
[0004]本发明实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，可以实现对未知病菌浓度的植物组织中病菌含量定量检测，结果准确，操作方便。
[0005]本文所述的柑橘黄龙病病菌是指韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)。[0006]本发明实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，包括：[0007]提供系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌DNA；[0008]对所述DNA进行琼脂糖凝胶电泳；[0009]对所得电泳条带进行分析，得到对应的条带亮度值；[0010]构建所述DNA的浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线；[0011]提供待测样品的DNA和柑橘黄龙病病菌的特异性扩增引物，进行PCR扩增；对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对所得电泳条带进行分析，得到待测样品的条带亮度值；根据所述标准曲线获得待测样品的DNA浓度。[0012]在一些实施例中，所述系列已知浓度的柑橘黄龙病病菌DNA可以通过荧光定量PCR扩增获得。
[0013]在一些实施例中，经试剂盒纯化的柑橘黄龙病病菌DNA的浓度可以通过仪器nanodrop2.0测得。
[0014]在一些实施例中，可以利用image J软件对琼脂糖凝胶电泳的电泳条带进行分析，得到条带亮度值。
[0015]在一些实施例中，所用的特异性扩增引物为：
[0016]
Hlbsf5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA
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Hlbsr5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT
[0017]在一些实施例中，可采用植物DNA提取试剂盒进行DNA提取，得到DNA样品。[0018]在一些实施例中，取含柑橘黄龙病病菌的组织(例如叶片或枝条)，提取DNA，采用上述特异性扩增引物Hlbsf/Hlbsr进行PCR扩增(反应循环数为30)，得到扩增产物，并通过琼脂糖凝胶电泳、胶回收得到纯化的DNA扩增产物；用仪器nanodrop2.0检测纯化扩增产物中DNA浓度，然后用ddH2O(超纯水)将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的工作液；分别以所述DNA浓度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的工作液为模板，采用上述特异性扩增引物进行PCR扩增(例如反应循环数为30)；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(例如上样量5μl/每份)，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用image J软件对扩增条带进行分析，得到每个对应的条带亮度数值，以模板DNA浓度为横坐标、所对应的条带亮度数值为纵坐标，构建标准曲线。
[0019]在一些实施例中，取待测含柑橘黄龙病病菌的组织(例如叶片或枝条)，提取DNA，采用上述特异性扩增引物进行PCR扩增(例如反应循环数为30)，得到扩增产物；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(例如上样量5μl/每份)，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用image J软件对扩增条带进行分析，得到对应的条带亮度数值；将所得的条带亮度数值代入上述标准曲线，获得待测含柑橘黄龙病病菌的组织的DNA浓度。[0020]在一些实施例中，柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法包括：[0021]1)取感染柑橘黄龙病的植物叶片，磨碎，用试剂盒(例如StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒)进行DNA提取，得到DNA样品；[0022]以已提取的DNA为扩增模板，采用上述特异性扩增引物Hlbsf/Hlbsr，进行PCR扩增反应；
[0023]扩增反应结束后，取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收纯化(例如使用琼脂糖凝胶回收试剂盒，StarPrep快速胶回收试剂盒)；[0024]对胶回收产物进行DNA浓度测量(可用仪器nanodrop2.0)，将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液(可用ddH2O，超纯水进行配制)；分别以浓度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的DNA为模板，采用上述特异性扩增引物Hlbsf/Hlbsr，进行PCR扩增；
[0025]PCR扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用image J软件对扩增条带进行分析，得到每个条带亮度对应的数值，以模板浓度为横坐标、亮度值为纵坐标，构建标准曲线；
[0026]2)另取待测样品的柑橘黄龙病菌DNA，按照上述程序进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、扩增条带亮度分析，获得条带亮度值，根据所述标准曲线获得待测样品的DNA浓度。[0027]本发明是基于PCR扩增技术、image J图像分析技术的植物组织含菌量的定量检测方法，可以快速的对黄龙病菌进行定量分析，同时对植株感病程度进行有效区分。[0028]本发明能够实现对植物组织内菌含量的定量检测分析，可以用于判断植物病情，以及病害等级划分。本发明方法为快速评估带菌植株的菌含量、感病程度以及病害防控提供一种有效的评价方法。本发明方法为黄龙病等植物病害的早期检测提供经济快速的定量，同时也为其防治提供准确的评价手段。
[0029]本发明通过用已知浓度的柑橘黄龙病菌DNA模板构建浓度与PCR扩增条带亮度之
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间的标准曲线，通过对未知浓度细菌DNA进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过与标准曲线进行对比，实现对未知浓度病菌的快速定量检测。附图说明
[0030]图1为本发明实施例柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法流程示意图。
[0031]图2为本发明实施例1所构建的DNA浓度与所对应的条带亮度值的标准曲线。[0032]图3、图4分别为本发明实验例中引物A2/J5，P1/P2，16sf/16sr，Hlbsf/Hlbsr灵敏度分析结果、引物浓度优化电泳结果。具体实施方式
[0033]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0034]实施例1
[0035]本实施例提供一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法，具体流程示意图参见图1。[0036](1)材料：两年生感染柑橘黄龙病的纽荷尔脐橙植株。温室无菌苗作为阴性对照。[0037](2)磨样处理：取脐橙叶中脉剪成1mm左右碎片，分别放入2ml试管中，加入直径为5mm钢珠，在震荡研磨设备上进行震荡研磨5min，频率30Hz。[0038](3)DNA提取：将研磨好的植物样本用试剂盒进行DNA提取，所用试剂盒为StarSpin柱式植物DNA提取试剂盒，得到50μl DNA样品。[0039](4)PCR反应体系：反应体系总提取为20μl。用已提取的DNA为扩增模板，加入4μl；选取特异性扩增引物Hlbsf(5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA)/Hlbsr(5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT)各加入0.4μl，2×Taq预混PCR反应体系10μl(无染料添加)，加入ddH2O(超纯水)5.2μl，配制成20μl反应体系，进行常规PCR(聚合酶链式反应)反应，反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min,PCR产物保存于4℃，反应循环数为30。扩增反应结束后，取5μlPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(StarPrep快速胶回收试剂盒，康润生物)对目标条带进行回收纯化。[0040](5)DNA模板定量：用仪器nanodrop2.0对胶回收产物、阴性对照进行DNA浓度测量，并用ddH2O(超纯水)将扩增产物配制成浓度分别为1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液，待用。[0041](6)标准菌浓度曲线的构建：分别以1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl浓度DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为模板4μl、引物Hlbsf(5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA)/Hlbsr(5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT)各0.4μl，2×Taq预混PCR反应体系10μl(无染料添加)，ddH2O(超纯水)5.2μl，配制成20μl反应体系，30个循环。[0042]PCR结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，上样量5μl/每份，通过凝胶成像系统得到扩增结果，利用image J软件对扩增条带进行分析，得到每个条带亮度对应的数值，
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以模板浓度为横坐标、亮度值为纵坐标，构建标准曲线，如图2所示。
[0043]通过选取未知菌浓度的柑橘黄龙病菌DNA按照上述程序进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、扩增条带亮度分析，发现亮度值为320，带入标准曲线对应的菌DNA浓度为6.7ng/μ。表明本实施例方法可以快速的对黄龙病菌进行定量分析，同时对植株感病程度进行有效区分。
[0044]实验例引物筛选实验
[0045]
[0046]
(引物A2/J5、P1/P2、16sf/16sr为常用引物，引物Hlbsf/Hlbsr是本发明新设计
的。)
1)分别对以上引物进行灵敏度实验。将已知浓度的柑橘黄龙病病菌的DNA溶液稀
释(10、100、200、500、800、1000、1500、2000、2500、5000、8000、10000)倍，分别作为模板，20μl PCR体系：10μl Mix，4μl模板，各引物的最佳浓度，用ddH2O补足至20μL，确定各引物所能扩增出目标产物的最低模板浓度，检测浓度最低的引物为灵敏度最佳引物。[0048]实验结果见图3。图3中，左上为引物A2/J5，右上为引物P1/P2，左下为引物16sf/16sr，右下为引物Hlbsf/Hlbsr；1-12稀释倍数依次为10、100、200、500、800、1000、1500、2000、2500、5000、8000、10000。结果表明，引物Hlbsf/Hlbsr的灵敏度最高。[0049]2)分别对以上引物最优浓度进行筛选。在20μL的PCR反应体系(同前)下，引物的加入量分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0μL，PCR反应结束后，取5μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(70V，50min)，扩增条带最清晰，引物二聚体亮度最低的浓度即为引物的最适浓度。
[0050]实验结果见图4。图4中，注：左上图为引物16sf/16sr浓度优化结果，右上为A2/J5浓度优化结果，左下为P1/P2浓度优化结果，右下为Hlbsf/Hlbsr浓度优化结果；1-6引物浓度依次为0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5μM，M为DNA marker。[0051]结果表明，相较于其它三对引物，Hlbsf/hHlbsr浓度在0.2μM时，灵敏度最高、扩增效果最好，可检测出每纳克总DNA中的柑橘黄龙病菌数在426～755范围。[0052]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0047]
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序列表<110> 北京农业信息技术研究中心<120> 一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法<130> KHP201115068.4<160> 8<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1tgtaaagctc tttcgccgga 20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2cttgacgtca tccccacctt 20<210> 3<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3tctgttttct tcgaggttgg tgag 24<210> 4<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4accgcaagac tccttaccag gaag 24<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5tcgagcgcgt atgcaatacg 20<210> 6<211> 20
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序 列 表
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<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6atttcacctc taacttaatc 20<210> 7<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7tataaaggtt gacctttcga gttt 24<210> 8<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8acaaaagcag aaatagcacg aacaa 25
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