(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104726490 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.06.24
(21)申请号 201310704929.8(22)申请日 2013.12.19
(71)申请人山东大学
地址250061 山东省济南市历下区文化西路
44号(72)发明人王向东 高鹏 魏光伟 李相芝(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人彭成(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)A01K 67/027(2006.01)C07K 14/765(2006.01)
权利要求书2页 说明书9页序列表13页 附图2页
(54)发明名称
表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法(57)摘要
本发明公开了一种表达人血清白蛋白的靶向载体，包含有人血清白蛋白基因，以及进行同源重组的鸡源的两个同源序列：5’同源臂、3’同源臂，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因EGFP。本发明的表达人血清白蛋白的靶向载体可以用于制备转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白，分离纯化方便，且由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。 C N 1 0 4 7 2 6 4 9 0 ACN 104726490 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种表达人血清白蛋白的靶向载体，其特征在于：包含有人血清白蛋白基因，以及进行同源重组的鸡源的两个同源序列：5’同源臂、3’同源臂，5’同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示，3’同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示，人血清白蛋白基因的5’端连接有kozak序列，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因EGFP。
2.根据权利要求1所述的表达人血清白蛋白的靶向载体的构建方法，其特征在于：设计特异性引物，进行5’同源臂、3’同源臂和人血清白蛋白基因的扩增；然后，用pBluescript II SK（+）载体构建同源臂与人血清白蛋白基因融合，然后将融合基因连接到EGFP-ROSA-26基因打靶载体上，再将3’同源臂连接到EGFP-ROSA-26基因打靶载体上，即得表达人血清白蛋白的靶向载体。
3.根据权利要求2所述的表达人血清白蛋白的靶向载体的构建方法，其特征在于：所述用pBluescript II SK（+）载体构建同源臂与人血清白蛋白基因融合的具体方式为：先将5’同源臂重组到pBluescript II SK（+）载体上，再将人血清白蛋白基因重组到pBluescript II SK（+）载体上，利用特异性引物将5’同源臂与人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来。
4.根据权利要求2或3所述的表达人血清白蛋白的靶向载体的构建方法，其特征在于：所述特异性引物如下：
用于扩增5’同源臂的引物为F1、F2：F1：5’-CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3’；如SEQ ID NO.5所示；F2：5’-CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3’；如SEQ ID NO.6所示；用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4：F3：5’-CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3’；如SEQ ID NO.7所示；F4：5’-CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’；如SEQ ID NO.8所示；用于扩增3’同源臂的引物为F5、F6：F5：5’-TTCCACATCCACCGGTTGGTTTATTTAGAGTGGCA-3’；如SEQ ID NO.9所示；F6：5’-GTTGGCGCCTACCGGACTGGCAGGGCTTATTTTCA-3’；如SEQ ID NO.10所示；引物F7，F8用于将连接到pBluescriptIISK（+）载体上的5’同源臂+人血清白蛋白基因克隆并加上infusion试剂连接所需的同源臂：
F7：5’-TCTTTCCAGTGGTTAGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3’；如SEQ ID NO.11所示；F8：5’-ATACGAAGTTATTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’；如SEQ ID NO.12所示。5.权利要求1所述的表达人血清白蛋白的靶向载体在制备转基因鸡中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体应用时，将权利要求1的表达人血清白蛋白的靶向载体转化鸡的原始生殖细胞，经过培养筛选后，利用显微注射技术，将转化成功的原始生殖细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。
7.一种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，其特征在于：通过同源重组的方法将权利要求1所述的表达人血清白蛋白的靶向载体重组入鸡的卵清白蛋白基因中，然后将转化成功的重组细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。
8.一种制备生物反应器的方法，其特征在于：所述生物反应器由转基因鸡输卵管组成，方法包括用权利要求1所述的表达人血清白蛋白的靶向载体制备转基因鸡。
9.一种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于：通过同源重组的方
2
CN 104726490 A
权 利 要 求 书
2/2页
法将权利要求1所述的表达人血清白蛋白的靶向载体重组入鸡的卵清白蛋白基因中，然后将转化成功的重组细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代，然后从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人血清白蛋白。
10.根据权利要求9所述的从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于：培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代后，分析F0或F1代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清组分中人血清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种鸡。
3
CN 104726490 A
说 明 书
表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
1/9页
技术领域
本发明涉及一种可利用转基因鸡的鸡蛋生产人血清白蛋白的靶向载体，涉及自主
设计、克隆多个适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及能够使人血清白蛋白重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡输卵管组织特异性表达的基因打靶载体ROSA26-shALBl，此载体的构建是后期获得能够在蛋清中表达人血清白蛋白的转基因鸡的核心技术，属于基因工程技术领域。
[0001]
背景技术
人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修复与再生等作用，是国际上使用最多的血液制品。临床上主要用于烧伤、失血性休克、水肿、低蛋白血症等的治疗。
[0003] 医用血清白蛋白的传统获得方法是从健康人血浆中提取，但由于血浆制品具有污染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使该方法受到很大限制，难以得到足够的血液制品。目前我们国家每年需要白蛋白120吨，而通过献血能制备的白蛋白仅为所需求量的1/3，因此，白蛋白供应严重紧缺。
[0004] 目前重组生物制药中普遍采用酵母、大肠杆菌发酵制备，但此方法存在诸多的缺点，例如：微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低、掺杂的微生物毒素难以彻底去除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产。因此，迄今为止，还没有相关产品上市。最近也有国际公司利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系统相比，动物生物反应器具有以下特点：1）生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质进行多种翻译后加工，非常接近天然产品；2）表达量大、成本低；3）产品易提纯、质量高，避免了其他生产方式的化学及生物毒素的污染，安全可靠；4）易产业化：转移的目的基因能够遗传，使某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。但人类基因是随机插入动物的基因组内，虽然与微生物发酵相比有很大优势，但也存在着很多不可控的因素和缺陷，有很大的改进空间：1）目的基因的整合与表达的效率较低；2）有可能引起宿主细胞基因突变；3）转基因模型与预期结果不符，或表达个体的机能紊乱；4）动物本身的相应的蛋白仍在表达，纯化中很难去掉，容易引起人类的过敏反应。因此，转基因动物还不是理想的生物反应器。[0005] 综上，寻求一种合适的表达人血清白蛋白的方法是亟需解决的问题。
[0002]
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法。本发明构建的载体能够使人血清白蛋白整合在鸡基因组中并以鸡的卵清白蛋白为标靶的进行基因敲入，将该载体转化入鸡的生殖细胞、得到转基因鸡后，其产生的卵（鸡蛋）中将特异性地表达人血清白蛋白。本发明通过基因重组技术对鸡进行遗传修饰，改变其基因组
[0006]
4
CN 104726490 A
说 明 书
2/9页
的组成，培育出能够在鸡卵（鸡蛋）中表达人类血清白蛋白的转基因鸡，并且确保这种遗传修饰的改变能够被子代继承，长久的传递下去。[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：[0008] 为满足上述的实验设计，本发明将适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及人血清白蛋白的基因重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡输卵管组织特异性表达的基因打靶载体ROSA26-shALBl，具体技术方案如下：
[0009] 一种表达人血清白蛋白的靶向载体，构建图谱如图1所示，结构为：包含有人血清白蛋白基因（序列如SEQ ID NO.2所示，所表达的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示），以及进行同源重组的鸡源的两个同源序列：5’同源臂、3’同源臂，5’同源臂为1.7kb（SEQ ID NO.3所示），3’同源臂为5.2kb（SEQ ID NO.4所示），人血清白蛋白基因的5’端连接有kozak序列，kozak序列为GCCACC，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因EGFP。[0010] 所述表达人血清白蛋白的靶向载体的构建方法，该方法的关键在于构建一种可以准确的将人血清白蛋白插入到PGC细胞的基因组中并能够成功表达人血清白蛋白的基因定点插入的载体，应用这种载体通过显微注射技术将完成遗传物质修饰的PGC细胞转入胚胎中，能够获得转基因鸡。该转基因鸡的输卵管细胞以及生殖细胞可由被修饰的PGC细胞发育而成，在形成卵的过程中表达产生人血清白蛋白，并且在其后代中稳定的传递转基因修饰，产生子代转基因鸡。构建方法具体如下：[0011] 通过NCBI进行检索，得到目的基因（人血清白蛋白的基因）后，设计特异性引物，进行5’同源臂、3’同源臂和人血清白蛋白基因的扩增（人血清白蛋白基因扩增后，在5’端增加了一个kozak序列）；然后，以EGFP-ROSA-26基因打靶载体（该载体记载在参考文献:Canonical NF-kappaB activity,dispensable for B cell development,replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation.Sasaki et al(Immunity.2006Jun.24(6):729-39.PubMed)）为基础，用于进行定点插入人血清白蛋白基因整合：用pBluescript II SK（+）载体（商品化的载体）构建同源臂与人血清白蛋白基因融合（先将5’同源臂重组到pBluescript II SK（+）载体上，再将人血清白蛋白基因重组到pBluescript II SK（+）载体上，利用特异性引物将5’同源臂与人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来），然后将融合基因连接到EGFP-ROSA-26基因打靶载体上（利用infusion试剂，该试剂为商品化产品），再将3’同源臂连接到EGFP-ROSA-26基因打靶载体上，即得表达人血清白蛋白的靶向载体；所有序列经过PCR获得。[0012] 所述特异性引物如下：[0013] 用于扩增5’同源臂的引物为F1、F2：[0014] F1：5’-CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3’；如SEQ ID NO.5所示；[0015] F2：5’-CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3’；如SEQ ID NO.6所示；[0016] 用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4：[0017] F3：5’-CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3’；如SEQ ID NO.7所示；[0018] F4：5’-CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’；如SEQ ID NO.8所示；[0019] 用于扩增3’同源臂的引物为F5、F6：[0020] F5：5’-TTCCACATCCACCGGTTGGTTTATTTAGAGTGGCA-3’；如SEQ ID NO.9所示；
5
CN 104726490 A[0021]
说 明 书
3/9页
F6：5’-GTTGGCGCCTACCGGACTGGCAGGGCTTATTTTCA-3’；如SEQ ID NO.10所示；
[0022] 引物F7，F8用于将连接到pBluescript II SK（+）载体上的5’同源臂+人血清白蛋白基因克隆并加上infusion试剂连接所需的同源臂：[0023] F7：5’-TCTTTCCAGTGGTTAGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3’；如SEQ ID NO.11所示；[0024] F8：5’-ATACGAAGTTATTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’；如SEQ ID NO.12所示。上述方法中：
[0026] 5’同源臂与人血清白蛋白融合基因上包含（5’-3’顺序）5’同源臂（1.7kb），为鸡卵清蛋白基因上游序列，包含有卵清蛋白启动子，5’同源臂两端引入两个酶切位点5’NotI/3’XmaI；[0027] Kozak（9bp）+人血清白蛋白cDNA序列（1.8kb）含有终止密码子，kozak序列存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用能够增强基因表达，酶切位点引入5’XmaI/3’ClaI；[0028] 3’同源臂（5.2kb）鸡卵清白蛋白序列中不引入酶切位点，通过infusion试剂连接。
[0029] 5’同源臂，kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列和3’同源臂均为PCR扩展产物，将kozak序列设计到引物中连接到人血清白蛋白cDNA序列的5’端；5’同源臂、kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列先连接到pBluescript II SK（+）再连接到EGFP-ROSA-26载体上。[0030] 所述表达人血清白蛋白的靶向载体在制备转基因鸡中的应用：将上述的表达人血清白蛋白的靶向载体转化鸡的原始生殖细胞，经过培养筛选后，利用显微注射技术，将转化成功的原始生殖细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。
[0031] 一种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，步骤为：通过同源重组的方法（原理图如图3所示）将上述表达人血清白蛋白的靶向载体重组入鸡的卵清白蛋白基因中，然后将转化成功的重组细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白（以鸡输卵管为生物反应发生器），而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。[0032] 一种制备生物反应器的方法，所述生物反应器由转基因鸡输卵管组成，方法包括用上述构建的表达人血清白蛋白的靶向载体制备转基因鸡。
[0025]
一种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，步骤为：通过同源重组的方法
将上述表达人血清白蛋白的靶向载体重组入鸡的卵清白蛋白基因中，然后将转化成功的重组细胞注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代（为增加产量，可分析F0或F1代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清组分中人血清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种鸡），然后从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人血清白蛋白。
[0034] 本发明通过基因敲入的方法将人血清白蛋白基因定点的插入到鸡的基因组中，以鸡的输卵管作为生物反应器表达目的蛋白。本发明通过同源重组的方法选择性的将目的片段插入鸡卵清蛋白基因中，这样的操作不会产生宿主其它部位基因的突变，而且能够很好的破坏其本身的卵清白蛋白表达，更重要的是，鸡的卵清白蛋白只在输卵管中表达，本发明
[0033]
6
CN 104726490 A
说 明 书
4/9页
引入的基因不会在鸡体内其他的部位表达。因此，相对于其它方法，本发明利用转基因鸡生产人血清白蛋白有着极为明显的优势：1）鸡具有世代间隔短、生产性能高、易于饲养和管理、成本低等优势。2）通过转入功能蛋白基因在鸡输卵管表达，将鸡输卵管作为生物反应器，能够使鸡蛋中含有人血清白蛋白，由于组成鸡蛋蛋清的蛋白质只有8种，转基因蛋白质容易从鸡蛋的成分中分离和收集。3）鸡蛋具有天然的无菌环境，表达的人血清白蛋白不容易受到污染。4）与其他的转基因方式产生的白蛋白相比，以鸡输卵管作为生物反应器制备的蛋白可正确糖基化，在鸡体内附着在新生多肽上的寡聚糖类比哺乳动物的更近似人类，所以由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。附图说明
图1：基因打靶载体构建示意图。[0036] 图2：载体构建的琼脂糖凝胶电泳鉴定图，通过图2可看出，构建本发明的载体所用的序列片段的大小与预期的一致。[0037] 图3：同源重组示意图。
[0035]
具体实施方式
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。[0039] 实施例中所涉及的试剂、方法，若无特别说明，均为本领域的常规试剂、常规方法。[0040] 实施例一 构建表达人血清白蛋白的靶向载体（构建原理示意图如图1所示）[0041] （一）鸡基因组DNA提取[0042] 1、取第10期鸡胚200mg剪碎，加SENT（包含有蛋白酶K50μg/ml和10%SDS）0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。[0043] 2、将匀浆液转移到1.5ml离心管中。[0044] 3、60C水浴3小时。[0045] 4、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。[0046] 5、离心5000g10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。[0047] 6、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。[0048] 7、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。[0049] 8、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。[0050] 9、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。[0051] 10、待絮状物出现后，离心5000g5min，弃上清液。[0052] 11、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g3min，弃上清液。[0053] 12、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50灭菌纯水溶解。[0054] （二）人血液中RNA提取[0055] 1、严格无菌操作，采新鲜血液2ml于3.8%柠檬酸钠抗凝管。[0056] 2、1,500rpm离心5min。[0057] 3、在超净台内小心将上层血浆吸出，同时用等量的Hank’s液补足2ml全血体积，
7
CN 104726490 A
说 明 书
5/9页
轻柔混匀。[0058] 4、取4ml淋巴细胞分离液于15ml灭菌透明塑料离心管中，将2ml补足体积的抗凝血小心地加于淋巴细胞分离液液面上，3,000rpm室温离心10min。[0059] 5、小心收集界面上的细胞，加入到含4ml Hank’s液的离心管中轻柔混匀，漂洗细胞。
[0060] 6、1,500rpm离心5min，重复漂洗一次，沉淀即为所需的淋巴细胞。[0061] 7、处理好的淋巴细胞，加入Trizol，1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。
[0062] 8、加入氯仿200μl，充分颠倒混匀1min，成均一的乳糜状，离心5min。[0063] 9、将上清液小心转移到RNase-free的1.5ml eppendorf里（离心分层后，可以吸取上层无色液体约为350μl，注意不要吸取任何中间层物质）。[0064] 10、将上清层转移到一干净的离心管中,加入等体积冰浴的异丙醇,颠倒振荡混匀，将混合的样品在-20℃条件下孵育20分钟以上，4℃，12,000×g离心10分钟。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。[0065] 11、弃去上清，用1ml冰浴的75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，颠倒洗涤离心管管壁，并旋涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4℃，12,000×g离心5分钟，再次去除上清，晾干沉淀。
[0066] 12、加入20ul高压的DEPC水进行溶解。[0067] （三）人源cDNA的合成
[0068] 1.将提取的人mRNA热变性，65℃，5min.后，立即置于冰上。[0069] 2.反应液配置：如下所示：[0070] 试剂及使用量：[0071] RNA溶液：2μg；5×RTBuffer：4μl；dNTP Mixture(各10mM)：2μl；primer（mix）：1μl；ReverTra Ace：1μl；Rnase free H2O：upto20μl。[0072] 3.反应条件：[0073] 65℃5min；[0074] 37℃15min；[0075] 98℃5min；[0076] 冰上5min；[0077] （四）PCR对5’同源臂、3’同源臂和人血清白蛋白基因进行扩增[0078] PCR反应体系如表1所示：[0079] 表1
[0080]
模板引物1
5’同源臂1ul1ul
3’同源臂1ul1ul
人血清白蛋白基因1ul1ul
8
CN 104726490 A
引物2高保真Taq酶mix反应体系纯水总体积
[0081]
1ul1ul25ul21ul50ul
说 明 书
1ul1ul25ul21ul50ul
1ul1ul25ul21ul50ul
6/9页
PCR反应条件如表2所示：
[0082] 表2
[0083]
5’同源臂
3’同源臂√√63℃5分钟√√
人血清白蛋白基因√√62℃2分钟√√
94℃预变性5分钟√变性30秒退火
延伸1kb/分钟72℃10分钟4℃
√62℃2分钟√√
[0084] “√”为实验过程中采取的相同的条件。[0085] （五）载体构建：
1、按照商品化试剂盒操作说明完成PCR产物的回收和纯化。进行下述的酶切和连
接反应。[0087] 2、酶切反应（如表3所示）：[0088] 表3
[0086] [0089]
[0090]
9
CN 104726490 A
说 明 书
7/9页
3、按照胶回收试剂盒操作进行酶切产物的回收。
[0092] 4、通过DNA连接酶在室温条件下进行连接反应，反应过夜后将DNA片段与载体连接（如表4所示）。[0093] 表4
[0091] [0094]
5’同源臂人血清白蛋白基因
pBluescript II SK（+）载体连接缓冲液T4DNA连接酶反应条件
[0095]
7ul7ul3ul2ul1ul室温过夜
5、将连接好的载体通过热激转化方法转化到感受态细胞中扩增重组载体。
[0096] 实验条件：20ul连接产物加入到200ul感受态细胞中，冰上放置15分钟，42℃热激1分钟，冰上放置2分钟，将细菌平铺在带有氨苄抗性的琼脂糖-LB固体培养基上。培养过夜。将长出的单一菌落选出，进行扩增后，提取质粒。（提取方法参见康维公司质粒提取试剂盒）。[0097] 6、ROSA26-shALBl载体的构建[0098] 6.1通过引物F5F6扩增3’同源臂F7F8扩增连接到pBluescript II SK（+）载体上的5’同源臂+人血清白蛋白基因序列，其中要说明的是引物F5F6上有15个相同的碱基F7F8上有15个相同的碱基。通过PCR的方法进行扩增后，纯化回收PCR产物。[0099] 6.2按照infusion试剂说明书进行连接反应。[0100] 6.3将连接好的载体进行“5”中的转化，扩增后得到带有人血清白蛋白的ROSA26-shALBl转基因载体，将得到的重组载体进行PCR鉴定，结果显示得到了目标重组载体（如图2所示）。
[0101] 实施例二 鉴定人血清白蛋白的表达：
[0102] 将实施例一构建好的含有同源臂和人血清白蛋白的基因打靶载体命名为ROSA26-shALBl载体，用AsiSI线性化。将5*106个DT-40（商业化细胞）重悬于400ul电转缓冲液中，加入20ug线性化的ROSA26-shALBl基因重组载体，指数式衰减脉冲(200V,with900–1,100uF)进行电转转化入DT-40细胞，转染24～48h之后再荧光显微镜先观察载体本身携带的发光蛋白GFP表达情况。Western鉴定人血清白蛋白在DT-40细胞中的表达情况。选取表达效率高的载体进行测序分析，将序列正确的载体大量扩增后，转入
10
CN 104726490 A
说 明 书
8/9页
PGC细胞。
[0103] 实施例三
[0104] PGC细胞培养:高糖DMEM培养液添加5%FBS、10ng/ml LIF、10ng/ml mlbFGF、10ng/ml SCF、0.lmmol/L MEM非必需氨基酸、0.lmmol/Lβ-琉基乙醇、2mmol/L L-谷氨酞胺、100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素为完全培养液。细胞按1x106个/孔的密度接种到6孔细胞培养板,置37℃含5%CO2的培养箱中，在饲养细胞层上进行培养，细胞在培养期间，隔天半量换液。饲养细胞一般为buffalo rat liver(BRL)cells大鼠肝细胞或者ouabain-resistant(STO)fibroblasts cells抗哇巴因的成纤维细胞。[0105] 传代与冻存：将细胞和培养基加到离心管中300g离心5分钟，将细胞重悬于包含有10%（胎牛血清）FBS，1%双抗（青霉素、链霉素）和10%DMSO的高糖DMEM培养基的冻存液中使其密度在2.5*104/ml，冻存于-80℃，24小时后放置于液氮。[0106] 实施例四 PGC细胞特性的鉴定
[0107] RT-PCR检测干细胞多能性标志基因的表达[0108] (一)总RNA提取:
[0109] 1.样品的制备:将培养的PGC克隆从饲养层上吹下,0.25%胰蛋白酶-0.05%EDTA消化成单个细胞,接种到铺有0.1%明胶的培养板中差速贴壁30min,除去混杂的饲养层,将富集的PGC离心收集；
[0110]
2.加lmL TRIzol到细胞中,剧烈震荡反复吹打,室温静置5min后,转入1.5m1EP
管；
3.按1ml TRlzol加入氯仿200ul的比例加入氯仿,并剧烈振荡30s充分混匀成
乳白状,室温静置5min；[0112] 4.12,000g，2-8℃离心15min,离心后管内分三相：下层红色的酚相,中间层为氯仿相,上层为无色的水相；
[0113] 5.RNA沉淀:将上层水相小心吸至OEPC处理的另一新EP管中,加入等体积的异丙醇,室温放置10min,于2-8℃小于12,000g离心30min取上清；[0114] 6.弃去上清,用1.5ml75%的乙醇清洗沉淀，剧烈震荡,于2～8℃以7500g离心10min，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽,于超净台内放置几分钟风干；
[0115] 7.总RNA浓度的测定:用紫外分光光度计检测OD260及OD280的值,计算RNA的浓度及OD260/OD280的比值。[0116] (二)cDNA的合成：[0117] 1.RNA热变性，65℃，5min.后，立即置于冰上；[0118] 2.反应液配置：如下：[0119] RNA溶液：2μg；5×RT Buffer：4μl；dNTP Mixture(各10mM)：2μl；primer（mix）：1μl；ReverTra Ace：1μl；Rnase free H2O：upto20μl；[0120] 3.反应条件：[0121] 65℃5min；
[0111]
37℃15min；
[0123] 98℃5min；[0124] 冰上5min。
[0122]
11
CN 104726490 A[0125]
说 明 书
9/9页
通过RT-PCR对培养的细胞CVH和Dazl基因进行鉴定，筛选出特异性表达PGC基
因的细胞用于后续实验。CVH（chicken homolog to vasa gene，cvh）是原始生殖细胞特异的分子标记物，为鸡原始生殖细胞特异表达基因。Dazl基因对生殖细胞早期分化起关键作用，该基因缺失或者突变能够使生殖细胞丢失，配子无法产生。
[0126] 测定PGC细胞端粒酶活性。用PBS缓冲液清洗细胞后收集细胞，用端粒酶检测试剂盒按照说明书操作，设立阳性对照及阴性对照。[0127] 实施例五
[0128] PGC细胞的遗传修饰，将组装完成的载体用AsiSI核酸内切酶线性化后，按照实施例二中的方法转化到PGC细胞中,电转同时设立阴性对照，在ROSA26-shALBl载体上含有neo基因，作为正筛选基因；HSV-tk基因作为负筛选基因，线性化DNA进入PGC细胞后，继续作体外培养，并以新霉素（G418）和致死核苷类似物（FIAU）作双重筛选。培养的前几天内不加入筛选药物，之后每2d都要更换一次含有筛选药物的培养基。因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使FIAU转变成一种有毒物质使细胞死亡。如果发生同源重组，由于HSV-tk基因在同源区之外不能整合，neo基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对FIAU无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。
实施例六 PGC细胞修饰的鉴定
[0130] 完成转染后的细胞筛选之后，需要进一步的对活下来的细胞进行鉴定，并且通过PCR和Western blot进行人血清白蛋白基因表达的鉴定，并用Southern blot来鉴定人血清白蛋白是否插入了PGC细胞基因组中，确定人血清白蛋白基因能够表达。[0131] 实施例七 转基因鸡的制备
[0132] 将筛选出的阳性PGC-hAlb细胞经过消化后，通过显微注射的方法将细胞注射入StageX的鸡胚中。将完成注射入后的鸡胚放置于37℃旋转孵化箱，直至完成孵化。[0133] 实施例八 转基因鸡的鉴定
[0134] 选取完成孵化的转基因鸡取血，分离出血细胞。通过PCR和Southern blot来检测是否有人血清白蛋白基因插入到基因组中，是否能够完成转录。饲养转基因鸡在其产卵后提取卵清蛋白进行Western blot检测，测定人血清白蛋白表达情况。
[0129]
12
CN 104726490 A[0001]
序 列 表
1/13页
[0002]
13
CN 104726490 A
序 列 表
2/13页
[0003]
14
CN 104726490 A
序 列 表
3/13页
[0004]
15
CN 104726490 A
序 列 表
4/13页
[0005]
16
CN 104726490 A
序 列 表
5/13页
[0006]
17
CN 104726490 A
序 列 表
6/13页
[0007]
18
CN 104726490 A
序 列 表
7/13页
[0008]
19
CN 104726490 A
序 列 表
8/13页
[0009]
20
CN 104726490 A
序 列 表
9/13页
[0010]
21
CN 104726490 A
序 列 表
10/13页
[0011]
22
CN 104726490 A
序 列 表
[0012]
23
11/13页
CN 104726490 A
序 列 表
12/13页
[0013]
24
CN 104726490 A
序 列 表
13/13页
25
CN 104726490 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
26
CN 104726490 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
27
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容