MHV—3诱导小鼠暴发性肝炎模型中γδT细胞的抑制性受体表达

MHV—3诱导小鼠暴发性肝炎模型中γδT细胞的抑制性受体表达

目的：通过分析在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，小鼠感染病毒前后γδT细胞其抑制性受体NKG2A表达情况，以此探讨爆发性肝炎初期疾病急速恶化的机制。方法：建立MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型，观察小鼠的死亡率；并检测在不同感染时间点0 h、12 h、24 h、48 h时对小鼠肝组织行伊红-苏木精染色（HE染色），观察肝脏病理学改变，ALT和AST水平。流式细胞学方法，标记γδT细胞，并标记其NKG2A的表达。结果：MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型中，γδT表面所表达活化性受体NKG2A表达维持低水平。结论：小鼠爆发性肝炎初期，肝脏重要的天然免疫效应细胞γδT细胞细胞表面抑制性受体NKG2A维持低水平表达，提示机体负调控机制缺失，导致γδT细胞可抑制性低下，最终引起免疫失衡。

标签： 暴发性肝炎； 3型鼠肝炎病毒； γδT细胞； γδT细胞抑制； NKG2A

重型肝炎依发病基础分为急性重型肝炎（暴发性肝衰竭）、亚急性重型肝炎（亚暴发性肝衰竭）及慢性重型肝炎。国内普遍认为暴发性肝衰竭、亚暴发性肝衰竭的时限分别为14 d内、15 d～24周（半年）。其中急性重型肝炎（暴发性肝衰竭）死亡率高达70%以上。有研究证实，3型鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus strain 3， MHV-3）诱导的小鼠暴发性肝炎，其病程转归及疾病预后和急性肝衰竭相似，因此该模型是研究急性重型肝炎良好的动物模型之一。肝脏是不仅是机体重要的消化器官也是重要的免疫器官，其中含有大量参与特异性免疫以及非特异性免疫的免疫细胞。T细胞免疫应答在感染性疾病中发挥着抗感染和清除外来病原微生物的重要作用。根据TCR两条肽链构成的不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞，αβT细胞在获得性免疫应答中发挥重要作用；而γδT细胞由于其分布特点和应答的非MHC限制性，在固有性免疫中发挥着独特的作用[2]。γδT细胞的功能调控（如NKG2D、NKG2A等相关分子），在天然免疫阶段具有相当的意义[3]。NKG2A作为γδT细胞的抑制性受体，其表达的改变，对疾病的进展有一定的意义。本试验利用MHV-3感染BALB/cJ小鼠，建立小鼠爆发性肝炎模型，通过检测小鼠肝脏中γδT细胞表面抑制性受体NKG2A分子表达，探求爆发性肝炎可能的干预途径。

1 材料与方法

1.1 材料 BLAB/cj 小鼠（雌性，6～8周龄）购于北京利华（实验动物）有限公司。饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院感染性疾病研究所（感染免疫实验室），SPF级，温度25 ℃，湿度70%。

1.2 试剂与仪器 MHV-3原种来自美国育种保育中心（Rockville，MD， USA），在本实验室以L2型单层种细胞进行扩增。可以以无菌PBS或生理盐水配置成合适浓度，用于模型建立。流式细胞仪分析不同荧光标记的抗小鼠单克隆抗体。CD3e，γδTCR，NKG2A，NKG2Aiso（分别以PECy-5.5，APC，PE进行标识）抗体均购于eB ioscience公司；无菌生理盐水购于上海百特医药公司；无

菌PBS为自行配制；Percoll购自Pharmacia公司。流式细胞仪购于BD公司，为本实验室固定财产。

1.3 方法

1.3.1 建立暴发性肝炎小鼠动物模型 MHV-3以无菌生理盐水重悬配置，制备感染液，合适浓度为500 PFU/ml。以腹腔注射方式感染小鼠感染每只小鼠腹腔注射200 μl感染液（100 PFU感染每只小鼠）。不同时间点3～10只，每次实验重复3次。对照组以无菌生理盐水以同等剂量注入小鼠腹腔。

1.3.2 小鼠肝脏非实质细胞获得 脊椎脱臼处死不同组别小鼠，取出小鼠肝脏。将肝脏置于不锈钢滤网（ 200目） 上， 用1 ml注射器吸取生理盐水反复冲洗，轻柔碾碎， 使得细胞经网进入平皿的PBS中，得到细胞悬液；500 r/min，离心机离心5 min，留取悬浮液，去沉淀；再次1500 r/min，离心机离心10 min，留取沉淀。取沉淀与10 ml 40% Percoll（原液与无菌PBS配制成） 充分混匀，离心。弃去上清，留取沉淀；用Tris-NH4Cl破去红细胞，PBS充分润洗；重悬后，即得肝脏小鼠非实质细胞悬液。

1.3.3 小鼠外周血清ALT以及AST的检测 取小鼠外周血，于华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科化验室进行检测。

1.3.4 小鼠肝脏病理切片制作 取小鼠肝脏，于福尔马林液中固定，于武汉谷歌生物有限公司进行伊红-苏木精染色（HE染色），并拍照。

1.3.5 细胞表型分析 收集待测细胞，离心，弃去上清。用PBS重悬混匀细胞，加入荧光标记的抗体，分别标记CD3e，γδTCR，NKG2A，NKG2Aiso，室温避光孵育20～30 min， 用PBS洗2次， 流式细胞仪上机分析。

1.4 观察指标 感染组小鼠死亡时间以及个时间点死亡率。检测小鼠外周血清ALT、AST含量。取小鼠肝脏制作HE病理切片后观察肝脏病理变化。流式细胞仪观察各组小鼠肝脏非实质细胞γδT细胞表达NKG2A受体的差异性。

1.5 统计学处理 使用SPSS 2.0统计学软件分析，并用GraphPad Prism作图软件进行绘制。计量资料以（x±s）表示，采用t检验或者ANOVA统计学方法分析数据，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MHV-3小鼠暴发性肝炎模型小鼠生存率观察 正常BLAB/cj小鼠腹腔注射生理盐水作为对照组，腹腔注射含MHV-3病毒生理盐水作为模型组。持续观察小鼠死亡时间及生存率见图1。72 h时，感染组小鼠开始出现死亡，直至120 h时，感染组小鼠全部死亡。见图1。

2.2 MHV-3暴发性肝炎模型小鼠谷丙转氨酶以及谷草转氨酶的检测 检测感

染组小鼠0 h、12 h、48 h、72 h小鼠外周血谷丙转氨酶以及谷草转氨酶含量。图2为小鼠暴发性肝炎模型0 h、12 h、48 h、72 h的血清ALT的含量，在小鼠腹腔注射MHV-3病毒48 h，血清ALT含量显著高于生理盐水对照组小鼠血清ALT含量。同时，小鼠暴发性肝炎模型48 h的血清ALT，显著高于该模型12 h、24 h的血清ALT 和AST 含量。见表1。2.3 小鼠肝脏病理学变化 分别选取未处理小鼠肝脏、腹腔注射生理盐水对照组的小鼠肝脏，暴发性肝炎模型48 h的小鼠肝脏进行病理学检查。腹腔注射生理盐水对照组的小鼠肝脏病理切片图与未处理组的肝脏切片相似；感染MHV-3，48 h后肝脏病理切片示肝细胞有较多的核分裂，有较多的中性粒细胞浸润，局部呈小灶性炎症细胞浸润，其周围有大量肝细胞死亡（符合重型肝炎病理学诊断）见图3。

2.4 γδT细胞广泛存在于MHV-3感染前后小鼠肝脏内。已有研究表明γδT可以广泛存在于机体免疫器官，γδT细胞作为重要的天然免疫细胞，发挥着重要作用。如图4所示，MHV-3感染前后，小鼠肝脏内均存在一定数量的γδT细胞。

2.5 NKG2A持续低水平表达 检测肝脏中γδT细胞表达γδT细胞抑制性受体NKG2A的比例， 以及抑制性受体NKG2A的平均荧光强度。流式细胞检测后发现感染MHV-3 48 h，小鼠肝脏γδT细胞表达NKG2A的细胞比例基本未发生变化，但是其活化受体NKG2A的平均荧光强度持续低水平表达（图5），另外NKG2A iso染色，排除非特异性染色。

3 讨论

在MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型中，小鼠感染病毒72小时开始出现死亡，直至120 h时，感染组小鼠全部死亡。该模型较好的反应了暴发性肝炎（肝炎重症化）的预后。另外综合小鼠外周血清ALT、AST含量变化与小鼠肝脏HE病理切片，选取48 h为该模型实验观察关键时间点，具有合理性。γδT细胞表面可以表达多种调节性受体，其中NKG2A是重要的抑制性受体。当NKG2A表达增高，γδT即被抑制，作为重要的免疫细胞，在天然免疫阶段发挥重要作用。当NKG2A在γδT细胞上持续低水平表达，受机体负调控机制缺失，导致γδT细胞可抑制性低下，γδT细胞可以被其他免疫调节细胞快速激活，而无法维持免疫稳态。因此，笔者用流式细胞技术检测小鼠肝脏非实质细胞γδT细胞以及其表面NKG2A表达。在现有现代免疫学技术条件下，该方法广泛应用于细胞表面标志物检测，得到广大国际同行认可。检测后，发现γδT细胞活化受体NKG2A的平均荧光强度持续低水平表达。此现象可能与重症肝炎预后较差有一定的联系。然而本实验仍有一定不足，如该小鼠模型仍不能完全等同于人类重症肝炎病理生理变化，其细胞表面标志物的表达是否与人类细胞有共性，以及细胞染色技术是否完全成熟，实验技术年代性局限等问题有待今后实验进一步完善。

重型肝炎是一类病死率甚高、严重威胁人们健康的肝脏疾病。我国病毒性肝炎防治方案（试行）将重型肝炎分为急性、亚急性和慢性重型肝炎。其中急性重型肝炎发病急，病死率高，研究其发病机制，治疗以及预后转归具有重要的临床意义。

γδT细胞作为一种有独特构成和独特功能的T细胞，近年来的研究不断升温[4]。如今，对于γδT细胞的抗原识别方式和无MHC限制性已达成共识[5]。但是，γδT细胞作为一群具有的效应功能的免疫细胞，其调控机制尚不明确。γδT细胞是固有免疫的效应性细胞，在病毒性感染疾病如柯萨奇病毒B3（ cox sack ievirusB 3， CVB3）、巨细胞病毒（Cy tomegalovirus， CMV ） 等发挥着重要作用[6-7]。因此，研究γδT的调控机制，对疾病的发病机制，生理病理学研究、疾病的治疗、疾病的转归、以及疾病的预防具有非常重要的意义[8-9]。在慢性病毒性肝炎小鼠模型中，γδT细胞可以大量杀伤肝脏细胞，因此，研究该细胞活化机制，对研究人类肝炎病毒诱发急性肝衰竭的发病机制，治疗方法有十分重要的意义。NKG2A作为γδT细胞表面重要的抑制性受体，表达的高低对于预后有一定的意义[10]。本研究表明，在小鼠暴发性肝炎（MHV-3）中，感染小鼠肝脏内γδT细胞表达NKG2A的细胞数量以及强度持续低水平表达。该实验提示，γδT细胞作为重要的天然免疫细胞，如能在暴发性肝炎早期，通过药物、基因调控、细胞治疗等方法提高γδT细胞表达NKG2A，则可能为疾病的治疗提供重要的方法。

参考文献

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