AM-AM-FS-Ac-17038 鱼种类的鉴定

AMAMFSAc17038  鱼  种类  鉴定  薄层聚丙烯酰胺凝胶等电位聚焦法

AM-AM-FS-Ac-17038

鱼种类的鉴定

1.仪器和试剂

1.1 仪器

    (a)薄层等电位聚焦仪——LKB2117多电极聚焦电泳仪或带有相同尺寸冷却平台和几何形状电极的等效的等电位聚焦仪。

    (b)电源——恒功率型。在1—30W间具有维持恒定功率的能力。恒电压型也可用手动间断地调高电压来保持恒定功率。

    (c)恒温循环器——使用水或防冻液通过冷却平台，使之在0—10℃循环。

    (d)盘——具塑料或金属盖。最小尺寸125×260×20mm，用于盛放固定、染色、褪色和防腐溶液。

    (e)玻璃板——125×260mm，盛放凝胶干燥用。

    (f)LKB两性电解质PAG平板——pH3.5—9.5。

1.2 试剂

    (a)固定溶液——混合150ml甲醇和350ml水，加入17.25g磺基水杨酸和57.50g三氯醋酸。一次性使用。

    (b)褪色溶液——混合500ml乙醇和160ml醋酸，用水稀释到2L。

    (c)染色溶液——溶0.230g考马斯亮兰R-250于200ml试剂 (b)中，使用前盖住容器，于水浴中加热至50—60℃，一次性使用。

    (d)防腐溶液——将50ml甘油加入500ml试剂 (b)中。

    (e)阳极溶液——1M H₃PO₄。

    (f)阴极溶液——1.0M NaOH。

    (g)绝缘流体——轻石蜡油 (粘度125/135)。

2.试验过程

    (注意:聚丙烯酰胺凝胶可能含有少量丙烯酰胺单体，如经皮肤吸收是有害的，操作时戴一次性的聚乙烯手套。)

2.1.样品的制备

    按17-36第一段[称取20—30g绞碎的样品放入捣碎机杯中加40—60ml水，高速捣混2min，倒入50ml离心试管，以1800rpm离心，直至分离完全(10—15min)，使上层清液通过折叠的WhatmanNo.1纸或用布氏漏斗抽滤，得到蛋白质提取液。]萃取肌浆蛋白质，离心所有萃取液，于4℃，1500×g，15min；或在冰箱中用WhatmanNo.1纸过滤。

2.2.测定

    步骤1——在上覆绝热流体(g)薄层的冷却平台上。放置为两性电解质PAG板提供的样板。避免产生气泡。

步骤2——沿PAG平板的包装边沿切掉以打开包装，不要切碎凝胶。如不需整块凝胶，PAG平板可切成1/3或1/2，剩余部分可封存在包装里，以备后用。用清洁的塑料膜盖好PAG板。

     步骤3——用塑料支架凸起的一端抬起PAG板，置PAG板于冷却平的样板上用绝缘油 (9)覆盖，以保持凝胶表面清洁，移开盖在凝胶表面的清洁塑料薄膜。

     步骤4——放电极条 (PAG板提供)，在清洁的玻璃板上，用1M H₃PO₄，(e)饱和电极条，电极条应显示出湿润的表面。放湿条于样板上标有阳极位置的PAG板表面，用干净、锐利的剪刀剪去其突出的一端。

     步骤5——如步骤4，只是在1M NaOH，(f)中饱和另一电极条。放湿条在样板上标出阴极位置的PAG板表面，用干净、锐利的剪刀剪去其突出的一端。

    步骤6——用干净的摄子捡取样品使用片，用微量移液管加5µL样品萃取液于其上，将片放在样板阴极上标明的样品使用区内的PAG板表面。如条的长边(10mm)与阴极条平行放置，可测16个样品；如条的短边 (5mm)与阴极条平行放置，可测量24个样品，相邻样品之间至少留5mm空隙。

    步骤7——放置电极盖(为聚焦电泳横跨凝胶宽度)于带有铂丝的凝胶上，铂丝位于电极条的中心。连接导线至聚焦电泳仪的接线柱，遵循正确的极性。

    步骤8——置安全罩于所在位置。连接导线至电源，遵循正确的极性。

    步骤9——电源设置条件——(1)恒功率电源——功率30W；最大电压：1.5kV；最大电流:50mA；稳定1.5hr以上。或对过夜的电子聚焦，功率:1W；最大电压:1.5kV；最大电流：50mA；稳定16h以上。

    如冷却平台温度是10—25℃或没有使用整张的PAG板，减小功率至10—15W持续2h；当用其它电源条件时，所用最大电压、电流和时间，应确保全部蛋白质己达到平衡。

    (2)恒压电源——恒电压设置方式，初始300V，每隔30min增加100V。为每一个条件的设置实验的测定最大电压和试验时间。

    不论用恒功率或恒压电源，最短的实验时间是指全部蛋白质达到其等电位点所需要的时间，10μl铁蛋白，马脾(10—15μg/μl)加到阳极和阴极样品区域内的样品载条上，作为平衡聚焦的指示剂。当阳极和阴极区域合并及聚焦时，即达到平衡。

    步骤10——30min后，关闭电源，取下安全罩和电极盖，取出样品载片，再放上安全罩和盖，继续分离。

    步骤11——分离结束，关闭电源，取下安全罩和电极盖，用摄子轻轻地从凝胶表面取下电极条。如果条粘在凝胶上，在电极条里边、连凝胶一块切下(不用塑料支撑)，弃去电极条。

    步骤12——立即置PAG板于固定溶液 (a)中，30min。

    步骤13——在褪色溶液 (b)中漂洗PAG板5min。

    步骤14——在热 (60℃)染色溶液 (c)中，染色PAG板10min。

    步骤15——更换数次试剂(b)为PAG板褪色。褪色过夜后，凝胶的底色应是清晰的，用经试剂 (h)浸湿的棉绒，轻轻从PAG板的表面擦去任何染料的沉淀。

    步骤16——将已褪色的PAG板上的蛋白质带形与预先用可靠(信)的种类在PAG板上的制备的带形比较。带形比较也可在第19步骤后进行。

    步骤17——褪色的PAG板置于防腐溶液 (d)中，60min。

    步骤18——室温下，在玻璃板上干燥PAG板过夜，防止灰尘等落在PAG板表面。

    步骤19——滚动塑料纸 (PAG板带的)盖在干燥的PAG板上，避免空气泡。干燥的PAG板贮藏于暗处，也可装订在笔记本中。

3.来源

AOAC  官方方法980.16（第17版）