单克隆抗体纯化工艺中Protein A层析介质的选择

1. 单抗分离纯化中的亲和层析介质

亲和层析具有专一、高效的特性。一般使用亲和层析纯化后，抗体的纯度一般大于95%以上，收率在95%以上；所以在抗体纯化工艺中一般使用亲和层析作为单抗纯化工艺的捕获步骤。在单抗分离纯化中使用的亲和层析主要是有：

ａ． 嵌合抗体，人源化，全抗体一般使用Protein A 或Protein G层析介质为捕获步骤； b. FC融蛋白一般使用Protein Ａ层析介质做捕获步骤；

c． Fab片段，或scFv 单链抗体一般使用Protein L层析介质捕获， Protein L (Capto L) 对轻链kappa片段有特异吸附。如果轻链的种类是Lambda，可以选择Lambda Select 特异的捕获。

d． 单区域抗体sdAb一般有VH区域，也可以使用protein A，如MabSelect 作为捕

获步骤。 1.1 Protein A 的性质

金黄色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区域结合。天然的protein A SPA是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的SPA 54KD，去掉与细胞壁结合部分的SPA 42KD。SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。

近几年来基因工程的SPA出现，解决了天然protein A的耐碱性问题，MabSelect Sure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的DACE 区域，对于B区域进行了修饰，将不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修饰后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；这就很好的解决了层析介质CIP的问题，同时修饰后的SPA也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对SPA的作用，使洗脱收集液中SPA的脱落更低。

Protein A 层析介质的发展历史（GE Healthcare 公司Protein A的 发展史）： 1958 年 Protein A 蛋白发现 1975年 杂交瘤细胞技术

1978年 Protein A Sepharose CL-4B ❶ 1988年 Protein A Sepharose Fast Flow ❶ 1994年 nProtein A Sepharose Fast Flow ❷ 1996年 rProtein A Sepharose Fast Flow ❸ 1999年 rmpProtein A Sepharose FastFlow ❹ 2001年 MabSelect ❺ 2005年 MabSelect Xtra

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❺

2005年 MabSelect Sure ❻

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2011年 MabSelect SureLX ❻ 注：

❶天然Protein A, 使用CNBr方法与琼脂糖偶联

❷重组protein A, 大肠杆菌表达，无动物成分来源，通过CNBr方法与琼脂糖偶联 ❸重组protein A, 大肠杆菌表达，通过稳定的硫醚键与琼脂糖偶联

❹重组protein A, 大肠杆菌表达，无动物成分来源，通过还原的氨基与琼脂糖偶联，可以多点与IgG结合，吸附两个IgG分子

❺重组protein A, 大肠杆菌表达，无动物成分来源，通过环氧键与高流速琼脂糖偶联。

❻重组基因工程protein A, 大肠杆菌表达，无动物成分来源。耐碱Protein A。通过环氧键与高流速琼脂糖偶联。LX为高载量。

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2.

用于捕获抗体的Protein A层析介质的选择

在Protein Ａ捕获步骤中主要去除的杂质：大部分HCP，DNA；由于 Protein A层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱pH，加入添加剂等 ；在此捕获步骤中会有Protein A（配基）的脱落。在Protein A捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基Protein A，以及Protein A与介质骨架的偶联方式，这些都是protein A的脱落原因。所以选择Protein A脱落较低的层析介质是非常必要的。

现在商业化ProteinＡ的介质较多，对于不同的项目如何选择：

a． Fc融合蛋白：一般Fc融合蛋白的DBC低于单抗。这是Fc融合蛋白的空间位阻效

应大于单抗。对于Fc融合蛋白MabSelect Xtra高动态载量的重组protein A介质是比较好的选择。 b． FC融合蛋白：如果Fc融合蛋白的稳定性差，尤其是在低pH缓冲液中，可以选择

MabSelect Sure。由于只有FC区域的结合，所以洗脱时的所用的pH较抗体高。 c． 表达量高，剂量大的项目可以选择Mabselect Sure LX。

d． 不同可变区的抗体在Protein A的DBC也不同，一般VH3 > VH 1>VH2 >VH4 e． 修饰后的Protein A 如：Mabselect Sure 对Fab没有亲和作用。

2.1 Protein A层析介质选择的策略

A． 耐碱性

药物GMP生产最基本的要求是无菌、无热源。NaOH 是最好的除菌、出热源的试

剂。同时NaOH也是公认的CIP试剂，使用NaOH 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；幵且NaoH的成本低。

NaOH是公认的CIP试剂，实验表明，NaOH的清洗效果高于其他试剂。如图，

NaOH清洗Protein A层析介质的效果。

图 用不同CIP试剂清洗后凝胶颗粒上的残留蛋白。SDS-PAGE（Deep Purple™染色）用于评估CIP试剂的清洗效率。NaOH是一种非常高效的清洗试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。CPG填料在高pH下不稳定，不适合用NaOH清洗。28-9500-94 GE poster

传统的protein A的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，幵且在配置时浓度较高，这对生产是一个瓶颈。

MabSelect Sure 系列是通过基因工程修饰的Protein Ａ介质，去除了不耐受

NaOH的氨基酸，提高了层析介质耐受NaOH的能力。同时 MabSelect Sure LX是最新的Protein Ａ 层析介质，结合了耐碱和高载量的性质。另外， Mabselect Sure和Mabselect Sure LX介质在NaoH清洗后寿命可以在300次以上。见图。

图。使用不同浓度的NaOH 清洗Mabselect Sure 的使用次数。随着抗体技术的发展，培养条件改善以及表达量的大幅度提高（生产规模已经到达3-5g/L），杂质

的量（HCP）也随之提高。如果不能将介质清洗干净，这会影响工艺以及产品的质量。在这种情冴下使用高浓度的NaOH （0.5M）的非常必要的（参考GE用于文献28987296）。

B．动态载量与保留时间：

一般Protein A层析介质的理论载量为80g/L左右。高载量可以减少层析柱的体积。保留时间是指样品在层析柱内的停留时间或样品与层析介质的接触时间。较低的保留时间可以使用较快的流速，从而提高生产效率。

在抗体纯化工艺开发时，对于动态载量以及保留时间是一个平衡的过程，单纯追求高动态载量，可能保留时间会较长，使得上样时间延长，这样培养基中的蛋白酶就有时间分解样品，以及上样时蛋白酶降解Protein A，使Protein A的脱落增加。另外一些高载量的protein A 层析介质，是通过提高配基密度（Protein A）增加动态载量的。但是配基密度提高过程中，如果配基与的层析基质（骨架）的偶联不稳定，就会增加protein A的脱落。此类Protein Ａ介质在初期动态载量较高，经过一段时间的使用，随着配基的脱落，载量很快降低。

单纯追求高流速，可能会使层析介质的柱压升高，提高了纯化过程中对生产设备（层析柱以及层析系统）的要求，从而增加层析柱以及层析系统的采购成本。随着上样次数的增多（生产循环次数的增加）层析介质的反压增加，从而减少层析介质的寿命。另外，有文献报道，以硅胶基质或CPG的在重复装柱的过程中易破碎，从而增加运行的压力以及影响介质的寿命。

现代的Protein A 的动态载量一般在35-60g/L之间，保留时间一般在3-5min左右（20cm柱床高度，线性流速在250-400cm/h ）。

随着细胞培养条件的改善，抗体的表达量的提高（由原来的1-2g/L提高到5g/L以上），对于Protein Ａ层析介质的关注从上样的速度转到关注上样的载量（DBC），关注的是DBC与上样的速度的平衡。JOB 848 （2007）28-39.

C. 低配基脱落

配基脱落在单抗药物中有严格的规定，在最终的药物中protein A 的残留<10ppm。所以Protein Ａ捕获步骤中，选择低protein A的脱落的层析介质对抗体药物质量控制以及工艺的风险控制是非常关键的。

Mabselect 系列层析介质的protein A残留在20ppm以下。采用环氧键与高流速琼脂糖偶联，增加了偶联稳定性，从而降低了Protein A的脱落。而其他商用Protein A介质的

Protein A为重组， 对于酶的耐受性，以及与骨架偶联的方式与Mabselect sure 不同，所以在纯化中配基脱离量较高，在100-200ppm 以上。

图，传统的Protein A与Mabselect Sure 配基在细胞培养液中，其中培养液中蛋白酶对配基的降解作用。传统的protein Ａ在培养液中１６ｈ后有大量的降解带，参考ＧＥ应用文献 １１００１１５９ＡＤ

Ｄ. 低非特异杂质吸附

Protein A捕获的样品是细胞培养的上清液。宿主蛋白是捕获步骤的主要杂质。虽然Protein A对抗体的Fc有特异性、专一性，但是层析介质的基质（骨架）有时会对杂质有非特异吸附。有文献报道以聚合物为基质的Protein A层析介质非特异吸附较高，洗脱时宿主蛋白会与抗体共同洗脱。从而HCP的残留量较高。

以琼脂糖为基质Protein A层析介质非特异吸附较低，一般的洗脱收集的样品中HCP的残留在100-200ppm 之间。而以聚合物或ＣＰＧ的骨架的protein A层析介质的HCP残留是琼脂糖骨架的10倍以上。

E. 层析介质压力/流速特性：

在生产中层析介质的装柱是必不可少的一项工作。这与小规模实验室层析柱的使用是完全不同的。生产中使用的层析柱一般直径在300mm以上；有些剂量大的项目，生产中需要使用直径1-1.4m的层析柱。生产规模层析柱的使用关键是：操作简便，装好的层析柱稳定（经过多次生产循环后，柱效、柱压、流速等关键操作参数稳定）。生产规模层析柱的装柱不只是层析柱的设计，层析介质的装柱方法是否适用，以及在装柱过程中层析介质是否易破碎时关键的因素。

商业规模的层析介质主要分为两种：层析介质的压力/流速曲线在放大过程中

例如：CPG为骨架的层析介质在装柱中需要不断震荡，以及装柱过程易碎。这可能会造成生产的潜在风险。CPG 或多聚物骨架的层析介质较硬，他的压力/流速曲线为：线性，即随着流速的加大而升高。所以在生产中由于层析柱（3-4bar）以及层析仪器（6bar）的限制。所以高流速耐压的性能不能实现；同时，在样品污染后，有不能使用苛刻清洗试剂清洗（例如：NaOH）所以在使用后期（一般几十的上样后，压力会超过层析柱的限定压力），是生产中断。

在层析介质的拆装过程中对于较硬的CPG骨架的介质容易破碎，从而进一步增加使用中的压力。

以琼脂糖为骨架的层析介质，有一定的弹性。加之可以很好的清洗，所以在生产中可以保持很好的压力/流速曲线。幵且GE Healthcare有丰富的层析柱的装柱经验，可以使层析柱在生产中更加稳定。

综上所述：在单克隆抗体的纯化工艺中Protein A的捕获步骤是十分重要的，选择：耐碱的、适合的载量、较低的配基脱落、较低的HCP残留、以及合适的压力/流速曲线的层析介质，可以延长层析介质寿命，减少生产成本，以及减少生产工艺的风险。

另外：2013年经过Oxford Analytica 公司认证，Mabselect系列层析介质在抗体工艺的研发以及生产中可以减少15% 的成本，提高15%的生产效率。