Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发，即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而利用Grynkiew icz公式可求游离Ca2+的浓度。 Grynkiew icz公式：
〔Ca2+〕i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）
其中，Kd为Fura-2和Ca2+结合的平衡解离常数,β是胞内零钙和饱和钙时在380nm的荧光强度比值,R是Ratio比值，Rmin是零钙时Ratio值，Rmax是饱和钙时的Ratio值。
Fura-2 Ratio法可用于测定组织块、器官、人工培养的单层贴壁细胞、血小板等胞内的游离钙。以下以人工培养的单层贴壁细胞为例介绍实验方法：此检测方法定量，具有快速，灵敏等优点。 测钙样品准备： 材料与方法 试剂：
1. DMSO 溶液：配置 10 ml 的含 20％ F127 的DMSO母液。
2. Fura-2/AM溶液：使用含20％F127 的DMSO 溶液溶解成 1 mM 的母液。如：使用 1 ml 20％ F127 的DMSO 溶液溶解 1 mg Fura-2 AM。分装 Fura-2 AM （1 mM 的 stock solution）成 1 ul 一管，储存于－70度冰箱，可以使用1年以上。此试剂购自molecular Probe公司。
3. K2H2EGTA，K-MOPS，KCI，CaCl2，二甲基亚砜 （dimethylsulfoxide，DMSO），多聚赖氨酸，Tris等均购自sigama公司。Pluronic F-127（表面活性剂有助于负载染料进入细胞），牛血清蛋白（albumin bovine，BSA，电泳纯）（与Pluronic F-127的功效类似）等试剂可购自Amresco公司。此外，上海生工、Invitragon（molecular Probe的代理、大连宝生等试剂公司均可提供相应试剂。 4. 配制校正Kd值的缓冲溶液： a. 1mM CaCl2溶液 b. 1mM EGTA溶液
c. MOPS缓冲液：100mM KCl，100mM KMOPS。
d. 0.1mM CaCl2：取10体积的1mM CaCl2，加入90体积的MOPS缓冲液，混匀。
e. 制备饱和钙溶液：取10ml 1mM的EGTA溶液，然后缓慢的加入0.1mM CaCl2，边加CaCl2边测PH值，会发现PH值降低，但加CaCl2到一定的体积后PH值稳定不再降低，记下此时所需的CaCl2体积V（一般情况下，不超过5ml）。 注：以上试剂的浓度较低，可先配制较高浓度的母液，稀释到所需的浓度。 5. 校正Kd的Ca-EGTA溶液
溶液A（零钙溶液）：100mM KCI，10mM K-MOPS，10mM K2H2EGTA，然后用KOH溶液调其PH值到7.2。配20ml溶液A，然后分装成两份，每份10ml。 溶液B（高钙饱和溶液）：此溶液的制备依据e 饱和钙液的制备方法。 取10ml的溶液A，缓慢加入V ml 1mM的CaCl2（V是制d 饱和钙液时的CaCl2体积数），然后KOH调节PH值到7.2。
注：溶液A、溶液B，都可从试剂公司，如Invitragen公司购买molecular probe fura-2专用校正试剂盒，使用非常方便。
制备梯度标准Ca-EGTA溶液：溶液A和溶液B按各种比例混合（0-100％）。见表1。
表1 制备标准Ca-EGTA溶液 溶液序号 CaEGTA 〔Ca2+〕free 溶液A 溶液B 0
0.00 mM 0 uM 2.00 ml 0.00 ml 1
1.00 mM 0.017uM 1.8 ml 0.2 ml
2
2.00 mM 0.038uM 1.778 ml 0.222 ml 3
3.00 mM 0.065uM 1.750 ml 0.250 ml 4
4.00 mM 0.1 uM 1.714 ml 0.286 ml 5
5.00 mM 0.15 uM 1.667 ml 0.333 ml 6
6.00 mM 0.225uM 1.600 ml 0.40 ml 7
7.00 mM 0.351uM 1.500 ml 0.50 ml 8
8.00 mM 0.602uM 1.333 ml 0.667 ml 9
9.00 mM
1.35 uM 1.00 ml 1.00 ml 10
10.00mM 39 uM 0.00 ml 2.00
并且使最终的0、1、2……10溶液均含有Fura-2/AM，终浓度均为2ug/mL，PH 7.2。 6. 负载溶液配制：
试剂储存液A：用无水的DMSO配置3mmol/L的fura-2/AM（fura-2/AM浓度与细胞有关，其值在1-10mmol/L之间）溶液。 储存液B液：10％（W/V）的pluronic F-127
负载溶液I（mmol/L）：130 NaCl, 3.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 MgSO4, 2.0 CaCl2, 24 NaHCO3, 10 葡萄糖，pH 值调至7.2。
储存液C液：用负载溶液I配制20mg/ml的BSA组分溶液。 负载溶液II：
按比例混合A、B、C液，其最终比例为A：B：C＝10：15：975
6. 封片液（缓冲甘油）： 取1份pH 9.5 的0.5 mol/L碳酸缓冲液（0.5 mol/L Na2CO3 : 0.5 mol/L NaHCO3，1 : 3，v/v）与9份甘油（试剂级，无荧光）经搅拌器彻底混合后，4℃冰箱保存备用。
7. 超纯水（如Milli-Q 超纯水，其电导率不小于18M欧姆） 实验材料准备：
将活化后的细胞接种到培养瓶中，置于CO2培养箱中培养（37℃、5％CO2），隔日更换培养基。待细胞铺满培养瓶底时，用0.25％的胰蛋白酶消化，消化完全后加入终止液终止消化，用吸管吹打均匀，接种入培养板中。培养24h后可用于测定胞内钙离子浓度。
实验步骤： 一、校正Kd值
Kd值是荧光信号和离子强度转换的很关键的参数，其值与温度、PH、离子强度等密切相关。常用的校正方法主要包括：体外校正法和体内校正法。体内校正法又可分为负载法、微注射法、细胞膜穿孔法、离子电渗法和电迁移法等等，其中负载法较常用。可按试验需求选用合适的校正方法。 1. 体外校正Kd值
1. 按表1的制备方法制备一系列的钙标准溶液，然后分别取5ul的溶液0、1、2、3……10
滴到培养皿底部，盖上18×18的盖波片。
注：培养皿经过特殊处理（底部带有特殊的盖玻片小室）、盖玻片需清洗彻底、凉干，消除污染物所带来的背景荧光。
2. 在显微镜下分别观察编号0、1、2、3…10的培养皿，分别在340nm、380nm激发，510n发射成 像的F340、F380以及相应的Ratio值。 &bsp;&; &bsp; &sp; 3. 根据已知的钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是 – logKd值，从而可求出校正后的Kd值。
注：为便于观察（如调焦）、保持盖玻片和载玻片的间隙，可在钙标准溶液中加直径15um的微球体悬浮物，密度达16000/ml（如购买fura-2校正试剂盒可付送微球体悬浮物）。
注：Kd与环境因子，如温度、PH、离子强度、染料与蛋白间的相互作用等因素相关，因此对系统进行Kd校准很关键。 2. 胞内校正Kd值（采用负载法）
1. 按表1制备一系列的钙标准负载溶液0、1、2、3、……10。其中，溶液A和溶液B均是采用负载溶液配制（注：采用高钙的校正浓度最高不超过2mM，所有溶液的Fura-2/AM的终浓度均为2ug/ml）。
2. 取贴壁生长的细胞培养皿11个，依次编号0、1、2、3、……10，并将培养皿的培养液弃去，分别用Ionomycin或者4-bromo-A23187（10um处理浓度，目的：破细胞膜使胞外的钙离子自由进入胞内），然后负载溶液I 轻轻漂洗3次。生长面朝上，在上面分别滴加约0.5-1 ml的负载溶液II（含有Fura-2/ AM染液）。
3. 室温孵育30分钟左右，间或轻轻晃动几次。
4. 孵育完毕后，用负载溶液I 轻轻漂洗3遍，以除去胞外残余的Fura-2/AM。 5. 制片，待检。利用显微镜Ca2+比率成像系统，检测在340nm、380nm激发的荧光强度值如F340、F380和对应的Ratio值。
6. 根据已知的标准钙离子浓度和对应的Ratio值作曲线，然后以log〔Ca2+〕为X轴，log（R-R0）/log（Rmax-R）为Y轴，作标准曲线。标准曲线在X轴的截距是– logKd值，从而可求出校正后的Kd值。
7. 体内校正Kd法，可同时校正Rmin、Rmax和β值。其中，零钙：可测得F380和Rmin；高钙：测得对应的F380和Rmax，从而可以求出β值。 注1：荧光显微镜下观察到负载后的细胞呈绿色，则表明负载成功，即荧光染料进入细胞。
当荧光标记的信号较低时，细胞内表现为紫色；当荧光信号增加时，胞内颜色由亮蓝色-黄色-红色。
注2：将指示剂导入细胞的方式有几种：（1）用微注射法将探针直接注入细胞内，适合于较大的细胞，限制比较多，而且容易产生损伤；（2）用荧光探针的酯化衍生物和细胞共同孵育法；（3）离子电渗法和电迁移法（主要通过电场作用影响细胞膜的渗透性，适合于带电荷的染料）。 其中（2）法简单、方便较广泛采用。
但是，也有研究发现Fura-2的酯化形式会大量沉积在细胞的分泌颗粒中被排到胞外，引起荧光的损失。
注3：测荧光强度时，为排除背景的干扰，校正R＝（F340-Fb） / （F380-Fb）。其中，Fb是细胞背景的荧光强度，Simple PCI软件可直接扣除背景的荧光强度，计算校正后的R值。
二、校正Rmin、Rmax和β值。
方法：利用体内校正Kd的Rmin、Rmax和β值。 三、Fura-2/ AM负载入细胞
1. 小心取出培养有细胞的培养皿，用负载溶液I轻轻漂洗3次；生长面朝上，在上面分别滴加负载溶液II（Fura-2/ AM染液的终浓度为2ug/ml）； 2. 将细胞放置于37℃细胞培养箱中，避光负载20-30min，
3. 用负载溶液I冲洗细胞1-3次，将细胞放置在37℃(25度或室温)下避光孵育， 20-30min。制片，待检。
4. 结合Calcium Fura-2检测参数：Ex=340nm, Em=510 nm；游离Fura-2检测参数：Ex=380nm, Em=510nm。
注1：具体操作可结合实际给药操作，适当调整。
注2：负载用的细胞培养皿，经多聚赖氨酸处理有利于细胞贴壁和生长。 多聚赖氨酸处理的步骤：将无菌的浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸Tris缓冲溶液（0.15mol/L,PH 8.4）约0.25ml滴在洁净无菌的培养皿底部过夜，使多聚赖氨酸粘附在培养皿底部。第二天吸去多余的多聚赖氨酸溶液，依次经去离子水、Tyrode溶液和去离子水浸洗两次。空气干燥并用紫外光照射15分钟后即可使用。
四、Fura-2/AM负载培养细胞的瞬间胞内钙动态变化的测量
将待检样品放在显微镜载物台上观察，通过Hamamatsu钙离子检测系统
（Hamamatsu AG CCD+SimplePCI软件系统+Zeiss Axiovert200倒置荧光显微镜）进行实时监测测定。在相同的环境下（同一光学系统、同一温度、恒定的曝光时间等）340nm和380nm间激发成像，测定一定时间序列胞内钙离子的荧光强度F340、F380、Ratio和钙离子浓度的变化。
注：1. R值也是校正后的Ratio＝（F340-Fb） / （F380-Fb）。
2. 先测静息状态的钙离子浓度，待其值稳定后，可对给药细胞检测钙离子的浓度变化情况。
五.成像系统实时检测过程与数据处理
1） 通过软件设置CCD、DG-4的控制参数：设定340nm、380nm滤光片自动切换时间、曝光时间等。
2） 在电脑上成像后，建立背景ROI，计算背景光密度值Fb以扣除背景。 3） 通过软件自动识别细胞样品，建立样品ROI区域。
4） 自定义计算参数F340、F380、R= （F340-Fb） / （F380-Fb）、[Ca 2+]i =KD x ß x (R -Rmin)/(Rmax- R)。
实时输出细胞340/380nm的荧光光密度比率变化曲线图和游离Ca2++的浓度变化曲线图 ，并存储数据。
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