测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法

分析测试学报

FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)

Vol.22No.4Jul.2003

测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的

高效液相色谱法

陈

勇,李德发,陆文清,朴香淑,杨文军,惠柏棣,韩雅珊

(1.中国农业大学动物科技学院国家饲料工程技术研究中心,北京100094;

2.中国农业大学食品学院,北京100094)

摘要:建立了一种分离和测定雨生红球藻中虾青素和其它色素的反相高效液相色谱法;含有雨生红球藻细胞的培养液经离心分离,匀浆破碎,用甲醇-二氯甲烷(体积比3B1)提取色素,提取液用HPLC分离测定;分析柱为Nova_PakC18(300mm@3.9mmID,5Lm)柱,流动相为水、甲醇和丙酮,流速1.0mL/min,用二极管阵列检测器在250~700nm波长范围扫描,在476nm处进行检测;虾青素、多种类胡萝卜素和叶绿素在30min内得到较好分离,其中游离虾青素、斑蝥黄质和B_胡萝卜素的检出限分别为3.56、1.36和29.4Lg/L,这3种类胡萝卜素分别在质量浓度为1.99~31.7mg/L、2.44~39.0mg/L、2.25~36.0mg/L范围内与峰面积线性关系良好,相关系数分别为0.9993、0.9987和0.9778;该法的精密度(RSD为0.09%~2.97%)和回收率(96%~102%)均符合方法学要求,可以用于研究和测定雨生红球藻中虾青素和其它色素的含量。关键词:雨生红球藻;虾青素;类胡萝卜素;叶绿素;高效液相色谱法中图分类号:O657.72;Q949.212

文献标识码:A

文章编号:1004-4957(2003)04-0028-04

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雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是一种广泛分布于自然界的淡水绿藻。在一定条件下(如应激、营养缺乏等),雨生红球藻能大量积累类胡萝卜素(可占细胞干重的2%~5%),其中80%以上为虾青素(astaxanthin)及其酯类。虾青素,又名虾黄质、龙虾壳色素,是海洋动物体内主要的类胡萝卜素之一,其化学名为3,3c_二羟基_4,4c_二酮基_B,Bc_胡萝卜素,分子式为C40H52O4,相对分子质量为596.86。近年来许多研究表明,虾青素具有许多重要的生物学功能,如抑制多不饱和脂肪酸的氧化、抵御紫外线的作用、维生素A样活性、改善视力、提高免疫力、促进色素形成、改善生育以及抗肿瘤等。目前,虾青素在水产养殖(如红鳟鱼、鲑鱼、虾和观赏鱼类等的人工养殖)中较广泛地用作饲料添加剂,取得了满意的着色及改善动物机体健康状况的效果[3]。

虾青素和其它类胡萝卜素的定量分析是研究雨生红球藻必需的基本方法。目前,国外已有文献用HPLC方法分离测定雨生红球藻中各种色素的含量,但许多方法分离时间较长或分离组分

[5][7][8]

较少。国内应国清等和许培雅等分别用HPLC检测虾壳和分光光度计法检测红发夫酵母中虾青素和其他色素的含量,但还没有见到采用HPLC法分离检测雨生红球藻中各种色素含量的报道。作者建立了一种快速而准确地检测雨生红球藻中虾青素和其它类胡萝卜素含量的方法。

[4~6]

[4]

[2]

[1]

1

1.1

实验部分

主要仪器及试剂

高效液相色谱仪为Waters2690分离系统(美国Waters公司),MassLynx色谱工作站。PowerGen

700D组织匀浆机(美国FisherScientific公司),Biofuge22R型低温高速离心机(德国Heraeus公司),8892型超声波清洗机(美国Cole_Parmer公司),NANOpure超纯水系统(美国Barnstead公司)。甲醇为色谱纯试剂;二氯甲烷和丙酮为分析纯试剂,使用前用0.45Lm的微孔滤膜(Millpore公司)过滤;所有实验用水均为超纯水。虾青素、斑蝥黄质(canthaxanthin)和B_胡萝卜素(B_carotene)等标准品均购自Sigma公司,纯度在95%以上。

分别准确称取9.5mg虾青素、11.7mg斑蝥黄质和10.8mgB_胡萝卜素标准品,用甲醇-二氯甲烷(体积比3B1)溶液配制成100mg/L的储备液(超声波促进溶解),存放于棕色瓶中,保存在2~8e冰箱,使用前配成合适含量的工作液用于液相色谱分析。

收稿日期:2002-08-07;修回日期:2003-05-16基金项目:/十五0国家科技攻关项目(2002BA514A-10)

作者简介:陈勇(1973-),男,湖北利川人,助理研究员,博士研究生;李德发,联系人.

第4期陈勇等:测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法29

1.2样品制备

取5mL雨生红球藻培养物于10mL试管中,3000g低温(4e)离心15min,弃去上清液,藻细胞沉淀用超纯水洗3次,加入2mL甲醇-二氯甲烷(体积比3B1)提取液,在低温环境下(试管外冰水冷却)用高速组织匀浆机28000r/min匀浆20s,匀浆液10000g低温离心15min,将上清液转移至另一试管中。重复以上色素提取步骤3~5次,直至藻细胞中色素基本提取完全,细胞沉淀物变为灰白色为止。将所有收集的提取液10000g再次低温离心15min,取上清液保存于-20e,待用。

1.3色谱条件

色谱柱为Nova_PakC18(300mm@3.9mmID,5Lm,美国Waters公司);流动相A为水,流动相B为丙酮,流动相C为甲醇;洗脱梯度为:9%A,15%B,76%C(0min);5%A,50%B,45%C(9min);4%A,58%B,38%C(15min);3%A,70%B,27%C(18min,保持至25min);100%B(27min,保持至28min);5%A,50%B,45%C(29min);9%A,15%B,76%C(30min)。流速为1.0mL/min;检测器为Waters996光电二极管阵列检测器;光谱扫描波长范围为250~700nm,积分定量用检测波长为476nm;进样量为30LL;自动进样系统样品盘温度4e;柱箱温度为25e。

2结果与讨论

雨生红球藻中含有多种色素,其各种组分的吸收峰在300~670nm之间,但作者主要对其中几种

2.1检测波长的选择

类胡萝卜素进行定量检测,重点考察的组分为游离虾青素和虾青素酯。游离虾青素和虾青素酯的吸收峰在470~480nm之间,而斑蝥黄质的吸收峰约为480nm,而其他类胡萝卜素在该波段也有较强的吸收

[4]

。根据对各色素吸收光谱的分析选用检测波长为476nm。

2.2色谱分离情况

由于雨生红球藻中含有许多种类的类胡萝卜素,要在较短的时间内将各组分完全分离是非常困难的。图1为虾青素、斑蝥黄质和B_胡萝卜素混合标样的液相色谱图,图2为雨生红球藻样品提取液的色谱图。从图1和图2可见,在本实验选定的色谱条件下,标准品及雨生红球藻样品中的虾青素、多种类胡萝卜素以及叶绿素都得到较好的分离,能满足研究和定量测定实际样品中虾青素和多种类胡萝卜素的需要。

2.3主要组分的定性

雨生红球藻中含有大量的叶绿素和多种类胡萝卜素,但由于条件所限,不能获得所有组分的标样。本法应用二极管阵列检测器在波长范围250~700nm进行光谱扫描,从而可根据组

[4]

分吸收的特征峰Kmax对各个组分进行定位。本系统中叶绿素a的吸收峰在431.8和663.8nm,叶绿素b的吸收峰在459.8和646.8nm,叶黄素(lutein)的吸收峰在446.8和474.8nm,而多种虾青素酯的Kmax为478.8nm;叶绿素a和叶绿素b的保留时间分别为14.89和10.54min,叶黄素的保留时间为6.99min,而多种虾青素酯则在10~25min内被洗脱出。在本法中应用的游离虾青素标样中还分离出(3S,3Sc)_13_cis_astaxanthin或(3S,3Sc)_15_cis_astaxanthin(两者在本系统中无法鉴别,Kmax为368.8和466.8nm),其保留时间为7.24min。

图1类胡萝卜素标准品的色谱图

Fig.1Chromatogramofthecarotenoids

standards

1.astaxanthin;2.canthaxanthin;3.B_

carotene

2.4线性关系及检出限

用外标峰面积法测定线性关系。准确吸取一定体积的虾青素、斑蝥黄质和B_胡萝卜素的标准储备液,配制成6个各

图2雨生红球藻中类胡萝卜素的

色谱图

Fig.2Chromatogramofthecarotenoids

inHaematococcuspluvialis

1.astaxanthin;2.canthaxanthin;3.B_

carotene

30分析测试学报第22卷

组分质量浓度不同的混合标准样品。分别取30LL进样。由色谱工作站处理数据,以各类胡萝卜素的质量浓度X(mg/L)为横坐标,相应的峰面积(Y)为纵坐标,得到3条标准曲线:虾青素,Y=3439.24X+59,r=0.9993,线性区间为1.99~31.7mg/L;斑蝥黄质,Y=3689.24X+37,r=0.9987,线性区间为2.44~39.0mg/L;B_胡萝卜素,Y=542.44X+43,r=0.9778,线性区间为2.25~36.0mg/L。结果表明,在该实验条件下,这3种类胡萝卜素的质量浓度与响应值线性关系较好。

按信噪比(S/N)为3计算检出限。各组分的检出限质量浓度Qmin(mg/L)按下式计算:Qmin=Q@3@N/h(式中:Q为标样的质量浓度,mg/L;N为仪器噪声,LV;h为标样峰高,LV)。3种类胡萝卜素的检出限分别为:虾青素3.56Lg/L,斑蝥黄质1.36Lg/L,B_胡萝卜素29.4Lg/L。

2.5精密度实验

将一混合标准溶液平行测定6次,计算各组分的峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1方法的精密度(n=6)

Table1Precisionofthemethod(n=6)

Compound

Astaxanthin(虾青素)

Canthaxanthin(斑蝥黄质)

胡萝卜素)B_Carotene(B_

Retentiontime

(tR?s)/min

5.55?0.1310.01?0.0621.85?0.02

RSDsr/%2.340.600.09

(A?s)/10LV11.68?0.1014.95?0.182.36?0.07

4

Peakarea

RSDsr/%0.861.202.97

2.6回收率实验

回收率实验采用加标回收法。取同样的样品3份,分别加入已知量的虾青素、B_胡萝卜素和斑蝥黄质标准品,按照前述样品处理方法进行处理并测定,平均回收率见表2。

表2方法回收率(n=6)

Table2Recoveryofthemethod(n=6)

Compound

Astaxanthin(虾青素)Canthaxanthin(斑蝥黄质)B_Carotene(B_胡萝卜素)

Original

-1

O/(mg#L)Q

2.1012.47.32

Added

-1

A/(mg#L)Q

7.929.759.00

Found

-1

F/(mg#L)Q

8.129.638.66

RecoveryR/%1029996

RSDsr/%2.81.34.7

2.7标样及样品稳定性测定

由于虾青素等类胡萝卜素和叶绿素容易受光照、氧化及温度影响因结构变化而发生降解,故本

实验研究了在该实验条件下样品的稳定性。将测定后的样品和混合标准溶液密封并避光保存在-20e冰箱中。于保存1~7、14和30d后测定样品中各组分的含量,计算各组分含量的变化率,结果表明:在保存1~5d内,各种组分含量变化均在?5%范围内;但5d以后各组分含量明显下降,其中游离虾青素含量、叶绿素的含量变化很大,甚至超过30%,而另外两种类胡萝卜素的含量变化在10%以内。所以,用本法测定雨生红球藻中色素的含量时,标样和样品溶液的保存时间最好不超过5d。

2.8雨生红球藻中虾青素及其它色素的测定

用该法对不同培养期(不同颜色)的雨生红球藻细胞中色素含量进行了分析,结果表明:培养早期(浅绿色)的藻细胞中叶绿素含量较高,而类胡萝卜素的含量很低,几乎检测不到游离虾青素和虾青素酯,可检测到微量的斑蝥黄质;培养中期(深绿色)的藻细胞中叶绿素含量很高,而类胡萝卜素含量则明显升高,可以检测到一定量的虾青素(3.47~6.59mg/L)、斑蝥黄质(0.89~3.21mg/L)和B_胡萝卜素(1.78~4.64mg/L);收获期(红褐色)的藻细胞类胡萝卜素的含量显著增加,其中游离虾青素(0.35~0.42mg/L)和虾青素酯(70.5~95.8mg/L)的含量可占类胡萝卜素总含量的78%~89%。

第4期陈勇等:测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法31

参考文献:[1][2][3][4][5][6][7][8]

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许培雅,郑裕国,沈寅初.分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量[J].浙江工业大学学报,2001,29(2):120-123,125.

DeterminationofAstaxanthinandOtherPigmentsinHaematococcusPluvialis

byHPLC

CHENYong,LIDe_fa,LUWen_qing,PIAOXiang_shu,

YANGWen_jun1,HUIBo_di2,HANYa_shan2

(1.NationalFeedEngineeringTechnologyResearchCenter,CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;2.CollegeofFoodScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

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Abstract:Agradientreversed_phasehighperformanceliquidchromatography(RP_HPLC)wasdevelopedfortheseparationofastaxanthinandotherpigmentsfromthepigmentextractsofthemicroalgaHaematococcuspluvialis.Algalcellswerecollectedbycentrifugingtheculturefluidat3000gfor15min,homogenizedandextractedusingthesolventmixtureofmethanolanddichloromethane(3B1byvolume).ChromatographicseparationwasperformedinNova_PakC18column(300mm@3.9mmID,5Lm)at25ewithaneluentconsistingofwater,methanolandacetoneataflowrateof1.0mL/min,theeluatewasmonitoredbyaphotodiodearraydetectorat476nm.Sep2arationandidentificationofchlorophyllsandmultiplecarotenoidswerecompletedin30min.Thedetectionlimitsofastaxanthin,canthaxanthinandB_carotenewere3.56,1.36and29.4Lg/L,respectively.Thelinearrangesofastaxanthin,canthaxanthinandB_carotenewere1.99~31.7mg/L(r=0.9993),2.44~39.0mg/L(r=0.9987)and2.25~36.0mg/L(r=0.9778),respectively.Thismethodisrapid,simple,preciseandaccu2rate(RSD0.09%~2.97%,averagerecoveries96%~102%),andcanbeusedforthequantificationofastax2anthinandotherpigmentsinHaematococcusPluvialis.

Keywords:Haematococcuspluvialis;Astaxanthin;Carotenoid;Chlorophyll;HPLC

*Correspondingauthor