植物组织MDA含量测定

、目的要求

1 •掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；

2•深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织 MDA含量测定的意义; 3•了解膜脂过氧化、氧自由基和 MDA形成的关系；

4•能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定 MDA含量； 5 •学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

二、实验原理

植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋 白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失 调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，

从而引发或加剧膜

脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙 二醛(Mai on dialdehyde，MDA )是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还 能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中， 植物的抗逆性。

MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸(TBA )反应，产生红棕色 的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮(Trimet—nine)，又名三甲川,该物质在532nm 处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收。由于TBA也可与其它物质反应， 并在532nm处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定 600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算 MDA的浓度。

即：A532 — A600= &CL

式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值，C是MDA浓度, L

MDA含量是一个常

用指标，可通过测定MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度 以及

100 C

O

---------------- —

HS

TBA MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮

CLJ

为比色杯厚度，£ =155L - mm(Cm-1。

O 需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对 MDA-TBA反应有干扰作用。可

HN

O O

N H

用下列公式消除由蔗糖引起的误差

C (卩 mol • ) =6.45 炉532一A6oo) — 0.56 A450

三、

材料与设备

1 •材料：四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。 2•仪器:

(1)分光光度计；(2)冷冻离心机；(3)水浴锅；(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀； ⑺5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml) ； (10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、 1ml) ； ( 12)冰箱。 3•药品

(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液；⑵5%三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先 用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml； (3) 0.5%的TBA溶液：称取0.5g硫代 巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml。 四、

实验步骤

1. MDA的提取：取样品0.5g (W)，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的 磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净， 清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。4500rpm，4度，离心10min, 上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积(V )。

2. MDA含量测定：吸2ml (V2)的提取液于刻度试管中(空白为 2ml缓 冲液)，加入3ml 0.5%的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10 min (自试管 内溶液中出现小气泡开始计时)。到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。 4500rpm，4度，离心10min,取上清液并量其体积(V1)。上清液于532nm、 600nm波长下测定吸光度。

3. 结果计算：

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VV^ V V2 W

MDA(nmol・g )= 6.452 (A532—A600)疋

式中，V1为反应液总量(ml) ； V2为反应液中的提取液数量(ml) ； V为提取 液总量(ml) ； W为植物样品重量(g)。 五、实验报告 样品 处理 重复 1 二 2 A532 A600 -1 MDA 含量（nmol g ） 高温处理 3 平均 标准差 绿叶 1 室温对照 2 3 平均 标准差 1 2 高温处理 3 平均 黄叶 标准差 1 2 室温对照 3 平均 标准差 思考题

六、

1. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？

2•提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？ 3 .为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？

4. 如果可溶性糖含量影响 MDA含量的测定，你有什么办法消除其影响？ 5. 正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。 七、

注意事项

1. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm）, 当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶 性糖的干扰。

2. 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度 过低时应补充Fe3+ （最终浓度为0.5 nmol L・）。 3. 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。

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