生理实验8蛙心灌流实验

实验八 蛙心灌流

钱涛 生命科学院

一、 实验目的

1、学习斯氏离体蛙心灌流法 2、了解心肌的生理特性。 3、观察动的影响。

二、 实验原理

维持心脏正常收缩的节律和强度，需要有一个适当的理化环境（离子的浓度、比例、溶液的酸碱度、环境温度等），这种环境条件稍有改变，便可影响心脏的正常活动。

心脏的正常节律性活动必须在适宜的理化环境里才能维持，一旦适宜的理化环境被干扰或破坏，心脏活动就会受到影响。心脏受植物性神经的双重支配，交感神经兴奋时，其未梢释放去甲肾上腺素，使心肌收缩力加强，传导增快，心率加快；而迷走神经兴奋时，其未梢释放乙酰胆碱，使心肌收缩力减弱，心率减慢。 把离体蟾蜍心脏，即失去了神经支配的蟾蜍心脏保持在适宜的环境中，在一定时间内其仍能产生节律性兴奋和收缩活动。这是由于蟾蜍的静脉窦能够自动按照一定的节律产生兴奋，并传导到其他心肌细胞，从而引起整个心脏有节律地兴奋和收缩。

离体心脏灌流，是在有控制的条件下研究体液因素以及药物对心肌作用机制的重要实验方法。两栖类动物心脏无冠状循环，心肌的血液供应直接来自心室腔，故灌流时套管插入心室腔内，但灌流哺乳动物心脏时则须通过冠状血管。 本实验是将蛙心离体后，用人工配制理化特性近似蛙血浆的任氏溶液灌流，在一定时间内，可保持节律性收缩和舒张，如改变任氏液的组成成分或浓度，心脏活动的强度和频率将受到影响。

三、 动物与器材

实验动物：蟾蜍4只/组。

实验器材： 蟾蜍解剖器械、生物/桥式前置、刺激/记录电极、蛙心插管、万向轮、蛙心夹、线、滴管、培养皿、支架、木夹、蛙针。

实验试剂：任氏液（含肝素）、0.65%NaCl溶液、2%CaCl2溶液、1%KCl溶液、1∶5000去甲肾上腺素溶液、1∶10000乙酰胆碱溶液、阿托品溶液、1％乳酸、2.5％NaHCO3。

四、 方法与步骤 一）离体蛙心制备

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、、及肾上腺素（Adr）、乙酰胆碱（ACh）对离体心脏活

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用刺蛙针捣毁蛙的脑和脊髓，将蛙仰卧固定于蛙板上。打开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏。在静脉窦下方穿一线供结扎静脉备用，在主动脉干下方穿一线作固定插管备用，在主动脉左侧分支下方穿一线结扎之。用眼科镊夹住主动脉干近根部，眼科剪于夹持处剪一斜切口，将盛有少量任氏液的蛙心插管由此切口插入主动脉，管头插至动脉圆锥时，插管稍后退并向左侧作 90°旋转，在心室收缩时向心室后壁方向下插，经主动脉瓣插入心室，可见插管内液体喷入血液并随心室的舒缩而上下波动。用线将动脉结扎固定于插管上，并将结扎线固定于插管的侧钩上以防插管滑出心室。轻轻提起插管将心脏抬高，于静脉窦与腔静脉交界处结扎静脉窦下方的备用线（注意不要扎住静脉窦，以免心脏停跳）。提起插管，在结扎线的远心端剪去所有组织，游离蛙心。用新鲜任氏液换取蛙心插管内含血的任氏液数次，直至插管内任氏液完全清澈。将蛙心插管固定于试管夹上，用蛙心夹在心室舒张期夹住心尖。将蛙心夹上的丝线连结于张力换能器上，调节该线

的张力。

图1 蛙心插管法

搭好装置，向蛙心插管内加入不同试剂进行实验： （1）将插管内的任氏液吸出，换入4℃的任氏液，观察曲线变化，待效应明显后，吸出灌流液，换入室温的任氏液，直至曲线恢复正常。再换用40℃任氏液实验。 （2）离子的影响

①吸出插管内全部灌流液，换入0.65%NaCl观察心缩曲线变化，待效应明显后，吸出灌流液，用新鲜任氏液换洗3次，直至心缩曲线恢复正常。

②加入1～2滴2%CaCl2于新换入的任氏液中，观察心缩曲线的变化。待出现效应后，用新鲜任氏液换洗3次至曲线恢复正常。

③加1～2滴1%KCl于新换入的任氏液中，待出现效应后，再用任氏液换洗至曲线恢复正常。 （3）递质的作用

①加入1～2滴1:10000去甲肾上腺素于灌流液中，待效应出现后，用任氏液换洗至曲线恢复

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正常。

②加入1滴1:10000乙酰胆碱于灌流液中，待效应出现后，用任氏液换洗至曲线恢复正常。 （4）药物的影响

加入1～2滴阿托品溶液于灌流液中，待效应出现后，用任氏液换洗至曲线恢复正常。

（5）酸碱的影响

①加入2.5%NaHCO3溶液1～2滴于灌流液中，观察曲线变化，待效应明显后，换用任氏液换洗，直至曲线恢复正常。

②加3%乳酸1～2滴于灌流液中，观察曲线变化，待效应明显后，再加1～2滴2.5%NaHCO3，观察曲线变化。

五、 实验记录

1 正常

图2 正常的心脏

2 40℃任氏液

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图3 加入40℃任氏液

3 4℃任氏液

图4 加入4℃任氏液

分析：温度降低，使心率减慢。 4 加0.65％NaCl

图5 加入0.65％NaCl

分析：灌流液中缺乏Ca2+，使得心肌内Ca2+浓度大大减小，心肌的兴奋收缩耦联过程减弱，心肌收缩能力减弱。

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5 加KCl

图6 加入KCl

分析：刚加入K+时，少量的K+竞争性抑制了Ca2+的内流，使胞内Ca2+浓度减小，心肌收缩力下降；经过十几秒后，高浓度的K+扩散到了心肌细胞附近，使心肌细胞的静息电位迅速升高，前后产生了心肌细胞外轻度高K+和显著高K+的现象。当到达-55mV时，Na+通道失活，心肌细胞无法引发动作电位而停泊在舒张期。

6 加CaCl2

图7 加入CaCl2

分析：心肌胞外Ca2+浓度显著增加后，一方面使心肌的自律细胞中的慢反应细胞自动去极化速度增加，起自律性增强，最终导致心率增加；另一方面，Ca2+内流增加，胞浆中的Ca2+浓度增加，肌钙蛋白得到更多的Ca2+，Ca2+兴奋收缩耦联增加，收缩力明显增强。

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7 加去甲肾上腺素

图8 加去甲肾上腺素

分析：加入去甲肾上腺素后，与心肌细胞上的β1受体结合，增加了肌浆网对Ca2+的通透性，主要起以下几个方面的作用：使心肌收缩速度增加；（2）使其自律性增强，心率增加；（3）使肌膜与肌浆网膜对Ca2+的通透性均增加，兴奋收缩耦联增加，心肌收缩力增加。

8 加乙酰胆碱

图9 加入乙酰胆碱

分析：加入乙酰胆碱后，它与肌膜上的M受体结合，使肌膜对K+的通透性增加，对Ca2+的通透性降低。这样，一方面导致心率减慢；另一方面使心肌收缩力

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下降。

9 加阿托品

图10 加入阿托品

分析：阿托品能与乙酰胆碱竞争M胆碱受体，从而有阻断乙酰胆碱的作用（阻断副交感），可以加快心率。

10 加1％乳酸

图11 加入1％乳酸

分析：pH值降低干扰肌肉代谢和肌丝滑行的生化过程；肌质网释放Ca2+减少； Ca2+内流减少。

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11 加2.5％NaHCO3

图12 加入2.5％NaHCO3

分析: HCO3-中和了H+，产生与乳酸相反的过程。

六、 注意事项

1、蛙心插管时，勿损伤心肌，尤其静脉窦。结扎静脉时，线结应尽量靠下，切勿伤及静脉窦（起搏点在该处），以免心脏停跳。

2、在每项实验观察前，应保持蛙心插管内液面在同一高度。

3、药物作用明显时应立即用新鲜任氏液换洗，直至心脏活动曲线恢复正常后再做下项实验。

4、在加化学药物与调换溶液时，须及时做好标记，不要凭记忆而弄错。 5、滴管应用药后洗净，避免药物相互混合，影响实验结果。

七、 实验讨论

一）上述理化因素对心脏活动的影响和其作用机理：

1、0.65％ NaCl: 灌流液中缺乏Ca2，使得心肌内Ca2浓度大大减小，心肌的兴奋收缩耦联过程减弱。

2、Ca2：用高Ca2浓度灌流蛙心，使细胞内Ca2浓度不断升高，Ca2与肌钙蛋白结合数量增加，肌肉收缩力增强；Ca2与肌钙蛋白不易解离，因而舒张不完全。

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3、K：K与Ca2有竞争性拮抗作用，高K浓度抑制Ca2内流，使进入细胞的Ca2减少，心肌兴奋收缩耦联减弱，心肌收缩力减弱，严重时心脏停于舒张状态。

4、去甲肾上腺素：去甲肾上腺素与心肌膜上的β1受体结合，通过细胞内第二信使cAMP促使肌质网磷酸化，释放Ca2速度加快，胞内Ca2量增加，收缩力增强；同时Ca2泵转运Ca2速度加快，舒张速率增加。

5、乙酰胆碱：乙酰胆碱与心肌M受体结合，K通透性增加，K外流加强，最大复极电位增加，与阈电位距离变大；同时Ca2内流减少， 产生一系列负性变作用。

6、阿托品：阿托品能与乙酰胆碱竞争M胆碱受体，从而阻断乙酰胆碱的作用（副交感），可以加快心率。

7、心得安：心得安有阻滞肾上腺素的作用（交感），使心率减慢，心脏收缩力减弱。

8、乳酸：pH值降低干扰肌肉代谢和肌丝滑行的生化过程；H与Ca2竞争，与肌钙蛋白结合位点结合，使ATP酶活性降低，对Ca2的敏感性降低，肌质网释放Ca2减少；H还能降低Ca2通道活性，使Ca2内流减少。

二）每次换液时，插管内的液面均应保持恒定高度。

以保持灌流液面的恒定即保持液压的恒定，防止液压因素对心脏造成影响。保证实验的条件一致，是实验可对照的关键。

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