红树林内生真菌的分离及代谢产物生物活性的初步研究

第４９卷２０１０年第２期　３月　中山大学学报（自然科学版）　ＡＣＴＡ　ＳＣＩＥＮＴＩＡＲＵＭ　ＮＡＴＵＲＡＬＩＵＭ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳ　ＳＵＮＹＡ　ＦＳＥＮ１　Ｖｏ１．４９　Ｎｏ．２　Ｍａｒ．　２０１０　红树林内生真菌的分离及　代谢产物生物活性的初步研究　邓祖军　，曹理想　，周世宁　（１．广东药学院基础学院，广东广州５１０００６；　２．中山大学生命科学学院／／有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州５１０２７５）　摘　要：从８种红树卡小植物中共分离出８５株内生真菌，经鉴定发现其主要类群为尤孢类群（Ｍｙｃｅｌｉａ　ｓｔｅｒｉｌｉａ），　短梗霉属Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ．和盘长孢属Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐｐ．，分别占菌株总数的５０．６％、１８．０％、１４．６％。对这　８５株内生真菌的代谢产物生物活性研究发现：其菌丝和发酵液提取物对试验细菌表现出较好的抗性：对大肠杆　菌有抗性的菌株比例分别为２２．４％、２１．２％、金黄色葡萄球菌为１２．９％、１４．１％，枯草芽胞杆菌为２０．Ｏ％、　３６．５％；其发酵液提取物对酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、白色念珠菌Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ、新月弯孢霉Ｃｕｒｖｕｌａｒ—　ｉａ　ｌｕｎａｔａ等试验真菌均有较好的抗性，抗性菌株占菌株总数的比例分别为２５．９％，２３．５％，２８．２％，而菌丝提取　物均未表现出抗性；有８株（占菌株总数的９．０％）可产生抑Ｓｌｉｄ，麦发芽和芽生长的代谢物，具有除草剂活性；　通过本实验建立的全细胞定向筛选模型发现：有１４个菌株的代谢产物对耐药性大肠杆菌具仃拈抗活性，占菌株　总数的１６．５％。以上结果表明：红树林内生真菌蕴含丰富的生物活性物质，在新型药物先导物和除草剂的开发　方面都表现出潜在的应用前景。　关键词：红树林；内生真菌；代谢产物；生物活性　中图分类号：Ｑ９３９．５　文献标志码：Ａ　文章编号：０５２９—６５７９（２０１０）０２—０１００—０５　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｍａｎｇｒｏｖｅ　Ｆｕｎｇａｌ　Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ　ＤＥＮＧ　Ｚｕｊｕｎ　一，ＣＡＯ　Ｌｉｘｉａｎｇ　，ＺＨＯＵ　Ｓｈｉｎｉｎｇ　（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｃｏｕｒｓｅｓ，Ｇｕａｎｇ　Ｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１　０００６，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／／Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ，　Ｓｕｎ　Ｙａｔ—ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１　０２７５，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｉｇｈｔｙ－ｆｉｖｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｉｇｈｔ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｔａｘａ　ａｒｅ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｓｔｅｒｉｌｉａ，Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ．ａｎｄ　Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐｐ．，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　１　８．０％，　１　４．６％ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｉｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｉｍａｒｉｌｙ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ—　ｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｈｙｐｈａ　ａｎｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｌｉｑｕｏｒ　ｈａｖｅ　ｇｏｏｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｉｓ　２２．４％．２１．２％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｔｏ　ＳｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣＵＳ　ａｕｒｅｕｓ　ｉｓ　１　２．９％，１４．１％，ｔｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｕｓ　ｉｓ　２０．０％，３６．５％；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｌｉｑｕｏｒ　ａｌｓｏ　ｈａｓ　ｇｏｏｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｌｕｎａｔａ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　２５．９％，　２３．５％．２８．２％ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｂｕｔ　ｔｈｅｉｒ　ｈｙｐｈａ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｈａｓ　ｎｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｆｕｎｇｉ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｓｔｒａｉｎｓ（ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ　９．０％ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ）ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｕｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｈａｖｅ　ｈｅｒｂｉｃｉｄａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒｔｅｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆ　ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ　１６．５％ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏ—　ｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　１　ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｂｙ　ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｏｄｅ１．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｆｕｎｇａｌ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ　ｗｏｕｈｔ　ｂｅ　ａ　ｒｉｃｈ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｐｏｏｌ　ｆｏｒ　ｎｅｗ　ｄｒｕｇ　ａｎｄ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔｓ；ｆｕｎｇａｌ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　收稿日期：２００９—０３一ｌ７　基金项目：国家高科技研究与发展（８６３）基金资助项目（２００７ＡＡ０９Ｚ４４８，２００８ＡＡ０９Ｚ４０２）　作者简介：邓祖军（１９７９年生），男，讲师；通讯作者：Ｊ吉１ｌ廿宁；Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｓｚｓｌ＠，ｎａｉｌ．ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　第２期　邓祖军等：红树林内生真菌的分离及代谢产物生物活性的初步研究　１０１　内生真菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）指生活于健康植物组　织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。这　类真菌在全部或部分生活周期生活在植物体内，与　植物形成互惠共生的关系：一方面，植物为内生真　ｌ０克，酵母粉１．０　ｇ，水１　０００　ｍＬ。③促孢培养　基：ＫＨ２Ｐ０４　１．０　ｇ，ＫＮＯ３　１．０　ｇ，ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ　０．５　ｇ，ＫＣ１　０．５　ｇ，淀粉０．２　ｇ，葡萄糖０．２　ｇ，蔗糖　０．２　ｇ，琼脂１５　ｇ，水１　０００　ｍＬ。　菌提供光合产物和矿物质；另一方面，内生真菌产　生的代谢物，或能刺激植物的生长发育，或能提高　１．１．３　试验菌及来源　金黄色葡萄球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏ—　ＣＯＣＣＵＳ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＩＣＰＢＰ　２６１　１２，屎肠球菌Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能　ｆａｅｃｉｕｍ　ＮＩＣＰＢＰ　３２２２３，铜绿色假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏ—　力¨－２１。关于内生真菌代谢产物生物活性的研究已　成为微生物资源开发的一个热点，目前已从植物内　生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、　抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等活性　代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示　出重要的应用价值　。　红树林作为自然生长在热带和亚热带海湾河口　潮间带的一种特殊的木本植物群落，一直处于高　盐、频繁的潮汐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧　污泥的特殊环境　。这类植物不仅在自然生态平　衡中起着特殊的作用，而且其化学成分也具有广泛　的药理活性ｌ８　Ｉ９　Ｊ。由于红树林生境独特且具有广泛　的药理活性，其内生菌可能蕴含着生物活性多样，　结构新颖的代谢物，因而红树林内生真菌引起了人　们的广泛关注。近年来关于红树林内生真菌类群和　代谢产物的抗肿瘤活性及抗氧化活性¨　“ｊ，抑制　乙酰胆碱酯酶活性研究已报道＿１’　，但对其抗　菌活性，特别是对耐药菌的抑制活性和除草剂活性　的研究很少有报道。本研究对深圳福田红树林自然　保护区的８种红树林植物的内生真菌进行了较为系　统的分离和类群分析，并对分离到的内生真菌进行　体外抗菌活性，除草剂活性的筛选，同时使用本实　验建立的全细胞定向筛选模型对红树林内生真菌拮　抗耐药菌的活性进行了研究，以期为保护红树林资　源、开发新型药物先导化合物和除草剂奠定基础。　１材料与方法　１．１　材料　１．１．１植物来源　桐花树Ａｅｇｉｃｅｒａｓ　ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ、　海漆Ｅｘｃｏｅｃａｒｉａ　ａｇａｌｌｏｃｈａ、秋茄Ｋａｎｄｅｌｉａ　ｃａｎｄｅｌ、木　榄Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ　ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ、白骨壤Ａｖｉｃｅｎｎｉａ　ｍａｒｉａｎ—　ａ、银叶树Ｈｅｒｉｔｉｅｒａ　ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、老鼠筋Ａｃａｎｔｈｕｓ　ｉｌｉｃｉ—　ｆｏｌｉｕｓ、无瓣海桑Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ　ａｃｉｄａ采集于深圳福田　红树林保护区。红树植物采集叶、根皮、气根、茎　皮。样品采集后放于冰盒中保存，在４　ｈ内处理样品。　１．１．２培养基（ｊ）ＰＤＡ培养基：马铃薯２００　ｇ，葡　萄糖２０　ｇ，琼脂１５　ｇ，Ｗ＝５０％人工海水１　０００　ｍＬ。　②玉米培养基（供发酵用）：黄玉米粉５０　ｇ，蔗糖　ｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＮＩＣＰＢＰ　１０１０４，白色念珠菌Ｃａｎ—　ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＡＴＣＣ　１０２３　１，酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＭＩＧ２．３４，大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ　８７３９，枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｕｓ　ＭＩＧ１．２２购自　广东省微生物研究所或中国药品生物制品检定所。　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｃ￣和卡那霉素抗性Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＩ５（ｐＲＥＰ４）　均为中山大学生科院有害生物控制与资源利用国家　重点实验室惠赠；ｐＢＲ３２２质粒（ＡｐｒＴｃｒ）购自华　美公司，新月弯孢霉Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｌｕｎａｔａ为本实验室　保存。　１．２方法　１．２．１　内生真菌的分离　参考文献［２］中方法　对红树林内生真菌进行分离和纯化。　１．２．２表面消毒效果检查参考文献［１５］方法　观察表面消毒效果。　１．２．３　内生真菌的鉴定使用ＰＤＡ培养基，采用　载玻片法培养内生真菌，根据《真菌鉴定手册》¨　中描述的真菌形态特征进行鉴定。不产孢子的菌　株，需使用促孢培养基或紫外线照射来诱导孢子的　产生，如还不产孢子将其归为无孢类群。　１．２．４　内生真菌代谢物的提取每种活化后的内　生真菌斜面培养物分别接种至１００　ｍＬ玉米粉培养　基，室温静置培养２８　ｄ后，用纱布过滤分开菌丝　体与发酵液，菌丝体用适量丙酮浸泡（没过菌丝　体）抽提菌丝体代谢物，将丙酮减压蒸干后，用　２．０　ｍＬ甲醇溶解代谢物；发酵液用等体积乙酸乙　酯萃取，取乙酸乙酯层分别低温干燥后，用　２．０　ｍＬ甲醇溶解代谢物。　１．２．５　内生真菌代谢物抗细菌、抗真菌活性检测　采用滤纸片法进行抗菌活性检测：活化后的大肠杆　菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与青枯菌培养　液用无菌水稀释至１０～，取０．１　ｍＬ菌悬液（约　１０　ｃｆｕ／ｍＬ）涂布于ＬＢ平板上。用滤纸片（直径　５　ｍｍ）吸取内生真菌代谢产物粗提物溶液，放置　于平板上，３７℃培养１～２　ｄ，观察抑菌圈的大小　及有无。白假丝酵母菌除取１０　稀释液２００　Ｌ涂　布ＰＤＡ平板外，其余均与细菌相同，并用空白滤　纸片吸取甲醇溶液作为空白对照；将丝状病原真菌　中山大学学报（自然科学版）　第４９卷　接种于ＰＤＡ培养基平板中央，在病原菌周围放置　用粗提物浸过的滤纸片，培养３～５　ｄ后观察病原　菌菌落生长情况，并用空白滤纸片吸取甲醇溶液作　为空白对照。　１．２．６除草剂活性检测　取１０粒小麦或绿豆种子　放于铺有吸水纸的培养皿中，将０．３　ｍＬ提取液混　入５．０　ｍＬ无菌水中，滴加至种子周围吸水纸上，　０．３　ｍＬ甲醇作为对照。２６　ｃｃＩ避光培养，观察并记　录发芽率及幼苗长度，发芽率低于５０％并且幼苗　最长长度低于对照长度５０％的记为有除草剂活性。　１．２．７全细胞定向筛选耐药茵耐药酶抑制物的筛　选模型　按照《分子克隆》介绍的方法，用　ｐＢＲ３２２质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ｏｔ，转化子具有在含　５０　ｇ／ｍＬ氨苄青霉素或５０　ｍＬ盐酸四环素的　ＬＢ平板上生长的能力。将Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ（ＡｐｒＴｃｒ）、　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５（Ｋｍ　）分别相应涂布于含５０　ｇ／ｍＬ氨　苄青霉素、５０　ｐ，ｇ／ｍＬ盐酸四环素或５０　ｇ／ｍＬ硫酸　卡那霉素的ＬＢ平板上，另用野生型大肠杆菌涂布　于不含抗生素的该型平板上，用滤纸片吸取提取液　放于含菌平板表面，２６℃培养，若出现下表中的　情况表明可能含有对大肠杆菌耐药酶基因表达或酶　活性有抑制作用的代谢产物（表１）。　表１　筛选中可能出现的情况与酶活的关系’　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎｓ．　１）“＋”表示有抑菌活性；“一”表示无抑菌活性　２　结果　２．１　红树林植物内生真菌类群分布　从红树林植物海漆、桐花树、秋茄、木榄、老　鼠筋、银叶树、白骨壤、无瓣海桑中分离出８５株　内生真菌。经鉴定发现其主要类群为：无孢类群　（占５０．６％）、短梗霉属（占１８．０％）和盘长孢属　（占１４．６％）。另外还有少量的曲霉属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．　（占５．６％），头孢霉属Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｐｐ．　（占５．６％）和镰刀菌属Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐｐ．（占３．３％）　（表２）。　表２红树林内生真菌的主要类群及所占比例　Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｘａ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔｓ．　主要类群　所占比例／％　短梗霉属Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　Ｉ８．０　盘长孢属Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ　１４．６　曲霉属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　５．６　芽枝霉属Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　１．１　头孢霉属Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　５．６　镰刀菌属Ｆｕｓａｒｉｕｍ　３．３　根霉属Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　１．１　无孢类群（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ）　５０．６　２．２红树林植物内生真菌代谢物生物活性研究　２．２．１　内生真菌代谢物对细菌、真菌的拮抗活性　对分离到的８５株内生真菌发酵后，提取代谢物进　行抗菌活性测定，结果发现其菌丝和发酵液提取物　对试验细菌都表现出较好的抗性：对大肠杆菌有抗　性的菌株比例分别为２２．４％，２１．２％、金黄色葡　萄球菌为１２．９％，１４．１％，枯草芽胞杆菌为　２０．０％，３６．５％；内生真菌发酵液提取物对酿酒酵　母、白色念珠菌、新月弯孢霉等试验真菌均有较好　的抗性，抗性菌株比例分别为２５．９％，２３．５％，　２８．２％，而菌丝提取物均未表现出抗性（表３）。　以上结果表明：在真菌发酵液中具有抗真菌活性的　菌株比例与抗细菌活性的菌株比例无明显区别，但　菌丝提取物中，产生抗细菌代谢物的菌株比例明显　高于具抗真菌活性的菌株比例。　表３红树林内生真菌代谢物对细菌、　真菌的拮抗活性　Ｔａｂｌｅ　３　Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｌａｎｇｒｏｖｅ　ｐｌａｎｔｓ．　菌种　第２期　邓祖军等：红树林内生真菌的分离及代谢产物生物活性的初步研究　１０３　２．２．２　内生真菌提取物对小麦幼苗的影响　筛选　结果发现有８个菌株（占菌株总数的９．０％）可产　生抑制小麦幼苗生长的代谢物，具有除草剂活性　（表４）。其中７个菌株的除草剂活性物质存在于菌　丝提取物中，仅有一个菌株（Ｂ８２）的发酵液表现　出除草剂活性。内生真菌的这个功能与其适应植物　组织内的生活有关，内生真菌利用这个功能与植物　组织的防御反应相平衡，当植物衰老或应激条件　下，具有此活性的菌株可能发展为该宿主的条件致　病菌。　表４　红树林内生真菌提取物对小麦幼苗的影响　Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｎ　ｗｈｅａｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　１）“＋＋”表示幼苗长度小于对照幼苗长度的２５％；“＋”　表示幼苗长度介于对照幼苗长度的２５％～５０％；“一”表示无活性　（　对照无区别）　２．２．３　内生真菌代谢物对耐药性大肠杆菌的作用　及机制　内生真菌代谢物对耐药性大肠杆菌的拮抗　实验表明：有１４株内生真菌（占菌株总数的　１６．５％）的代谢物对耐药性大肠杆菌显示拮抗活　性：内生真菌Ｂ２、Ｂ１２、Ｂ２０、Ｂ６３产生的代谢产　物对耐氨苄青霉素、四环素的菌株有抑制作用，但　对耐卡那霉素与对照菌株无活性（表５）。由于氨　苄青霉素、四环素抗性基因均位于同一质粒　ｐＢＲ３２２上，所以推测这些代谢物的作用机制是消　除质粒ｐＢＲ３２２。Ｂ１６的代　十物对耐四环素活性、　耐卡那霉素活性有影响，可能这两株真菌产生的代　谢物影响到四环素外运蛋白与卡那霉素修饰酶的功　能或消除ｐＲＥＰ４质粒。Ｂ２７、Ｂ３９、Ｂ４７、Ｂ４９的代　谢物对耐氨苄青霉素活性、耐卡那霉素活性及对照　菌株没有明显影响，仅对耐四环素活性有抑制作　用，该代谢物影响到四环素外运蛋白的功能；同样　原因，Ｂ２７的菌丝提取物中有影响耐卡那霉素活性　的代谢物；Ｂ４８菌株对三种耐药活性均有影响但对　对照菌株无影响，因此该代谢物作用方式为消除两　种耐药质粒；Ｂ２０的菌丝提取物仅对耐卡那霉素活　尢影响，推测该物质被卡那霉素修饰酶失活，因　而对不具此活性的其他菌株有拮抗活性。从以上结　果可以看出，一些红树林内生真菌可产生影响大肠　杆菌耐药酶（基因）的物质，并且抗性机制多样。　表５红树林内生真菌代谢物对耐药性　大肠杆菌的作用　’　Ｔａｂｌｅ　５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　测试菌株　菌株　真菌　耐药菌株　编号　种类　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｃｒ　Ｅ　ｃ０儿Ａｐｒ　Ｅ·ｃｏ此ＫＩＴｌｒ　Ｅ　ｃｏ　ＡＴｃｃ８７３９　ＤＨ５　ＤＨ５　Ｍ１５　Ｂ２无孢类群　＋　＋　一　一　Ｂ１２无孢类群　＋　＋　一　一　Ｂ１６无孢类群　＋　一　＋　一　Ｂ２０无孢类群　＋　十　一　一　Ｂ２７无孢类群　＋　一　一　一　Ｂ３７无孢类群　＋　一　一　一　Ｂ３９无孢类群　十　一　一　一　Ｂ４７无孢类群　＋　一　一　一　Ｂ４８无孢类群　＋　＋　＋　一　１３４９无孢类群　十　一　一　一　Ｂ６３无孢类群　＋　＋　一　一　Ｂ２０　无孢类群　＋　＋　一　十　Ｂ２７　无孢类群　一　一　＋　一　１）　菌丝提取物；＋显示抑菌活性；一无抑菌活性　３讨论　在目前耐药性菌株造成的感染日益严重的情况　下，寻找新的抗生素资源十分必要。目前关于寻找　新的抗生素的主要方法有两种：一种是建立新的筛　选模型以在已知的资源库中筛选以前尚未发现的活　性物质；另一种是寻找新的资源库。过去筛选产生　抗菌物质微生物的重点一直是土壤微生物，特别是　链霉菌。但自２０世纪６０年代以来，从链霉菌中被　重复发现的抗生素高达９５％，筛选得到的有价值　的抗生素比率逐年下降＿２　Ｊ。于是人们将筛选抗菌　物质的注意力逐渐集中于其他生态系统的微生物，　尤其是那些特殊生境的微生物如海洋微生物、植物　内生菌等　。红树林内生真菌由于其特殊生境，　同时具有海洋微生物和内生菌的特点，其代谢产物　中山大学学报（自然科学版）　第４９卷　已成为寻找新药源的重要资源库。我们的研究结果　发现：红树林内生真菌的发酵液对大肠杆菌、金黄　色葡萄球菌，枯草芽胞杆菌，酿酒酵母、白色念珠　菌、新月弯孢霉等试验菌均有较好的抗性，抗性菌　株比例分别为２１．２％，１４．１％，３６．５％，２５．９％，　２３．５％，２８．２％；１６．５％菌株的代谢物对耐药性大　肠杆菌显示较好的拈抗活性。这表明红树林内生真　菌蕴含丰富多样的生物活性物质，值得深入研究和　开发。红树林内生真菌发酵液提取物对试验真菌都　有较好的抗性，而其菌丝提取物均未表现出抗性，　菌株Ｂ２０、Ｂ２７的菌丝与培养液中代谢物的对耐药　大肠杆菌的活性明显不同，这都表明红树林内生真　菌功能具有多样性，在其活性产物筛选的时候值得　注意。　本研究设计的氨苄青霉素、卡那霉素、四环素　抗性酶抑制剂筛选模型将传统的全细胞筛选与定向　靶位点筛选方法的优点结合起来，可避免采用单一　方法带来的缺点，同时，这三种抗生素抗性酶实际　上代表了细菌耐药的三种机制：即抗生素水解酶、　抗生素修饰酶与药物外运蛋白。在筛选出具有抑制　耐药菌株的活性物质的同时，对其抑制的机制也能　目了然。并且我们的目标靶位点并不是正常情况　下微生物生长所必需的酶而是在特殊情况下（有　抗生素存在时）微生物生长所必需的酶，因此很　可能筛选到以前被忽略的化合物。同时，对于病原　菌来说，其毒力因子是病原菌进入并生活于宿主体　内所必需的，如果以病原菌毒力因子作为靶位点，　筛选到的抗生素将对自由生活的微生物影响较小，　这种“定向”抗生素可影响侵入人体内的病原菌　的生长，对于病原菌在其他环境中的生长则影响较　少，因此可以缓解现在严重的耐药性问题＿１　。因　此通过该模型筛选出来的抗性菌株在针对耐药性菌　种的治疗具有良好和广泛的应用前景，目前正在对　这些抗性菌株中具体的活性成分做进一步的研究。　参考文献：　［１］赵云涛，李倩茹，陈绍红，等．红树林内生真菌的抗氧　化作用［Ｊ］．湛江海洋大学学报，２００５，２５（６）：９３—　９６．　［２］邓祖军，曹理想，谭红铭，等．红树林内生真菌抗细菌　和抗真菌活性的初步研究［Ｊ］．广东药学院学报，　２００７，２３（５）：５６３—５６８．　ｆ３１任安芝，高玉葆．植物内生真菌一一类应用前景广阔　的资源微生物［Ｊ］．微生物学通报，２００１，２８（６）：９０　９３．　［４］　ＳＴＲＯＢＥＬ　Ｇ　Ａ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ　ａｓ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｄ—　ｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２００３（５）：５３５—　５４４．　［５］　ＳＴＲＯＢＥＬ　Ｇ　Ａ，ＤＡＩＳＹ　Ｂ，ＣＡＳ￣ＬＬＯ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔｕｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎａｔ　Ｐｒｏｄ，２００４．６７：２５７—２６８．　［６］　ＳＴＲＯＢＥＬ　Ｇ　Ａ，ＭＩＬＬＥＲ　Ｒ　Ｖ，ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＭＩＬＬＥＲ　Ｃ，　ｅｔ　ａ１．Ｃｒｙｐｔｏｃａｎｄｉｎ，ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏ·　ｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｕｓ　Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｏｐｓｉｓ　ｃｆ．ｑｕｅｒｃｉｎａ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉ—　ｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５：１９１９—１９２６．　［７］林鹏．中国红树林研究进展［Ｊ］．厦门大学学报：自然　科学版，２００１，４０（２）：５９２—６０３．　［８］　王友绍，何磊，王清吉，等．药用红树植物的化学成分　及其药理研究进展［Ｊ］．中国海洋药物，２００４，９８（２）：　２６～３１．　［９］　赵亚，郭跃伟．真红树林植物化学成分及生物活性研　究概况［Ｊ］．中国天然药物，２００４，２（３）：１３５—１４０．　［１０］　ＳＡＲＭＡ　Ｖ　Ｖ，ＨＹＤＥ　Ｋ　Ｄ，ＶＩ　Ｉ’ｒＡＬ　Ｂ　Ｐ　Ｒ．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｏｃｃｍＴｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｆｕｎｇｉ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅａｓｔ　ｃｏａｓｔ　ｏｆ　Ｉｎｄｉａ［Ｊ］．Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ，２００１，４５５：４１—５３．　１　１　１］　ＡＮＡＮＤＡ　Ｋ，ＳＲＩＤＨＡＲ　Ｋ　Ｒ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｍａｎｇｒｏｖｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｏｉｌ　ｔｈｅ　ｗｅｓｔ　ｃｏａｓｔ　ｏｆＩｎｄｉａ［Ｊ］．Ｃａｎ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，４８（１０）：８７１—８７８．　［１２］郑忠辉，缪莉，黄耀坚，等．红树林内生真菌的抗肿瘤　活性［Ｊ］．厦门大学学报：自然科学版，２００３，４２（４）：　５ｌ３—５１６．　［１３］　吴雄字，李曼玲，胡谷平，等．南海红树林内生真菌　２５０８代谢物研究［Ｊ］．中山大学学报：自然科学版，　２００２，４１（３）：３４—３６．　［１４］　罗景慧，杨迎暴，林永成，等．中国南海海岸红树真菌　Ｘｙｌａｒｉａ　ｓｐ．代谢产物在体外对乙酰胆碱酯酶活性的　影响［Ｊ］．中药材，２００４，２７（４）：２６１—２６４．　［１５］ＣＡＯ　Ｌ　Ｘ，ＹＯＵ　Ｊ　Ｌ，ＺＨＯＵ　Ｓ　Ｎ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ｆｒｏｍ　Ｍｕｓａ　ａｃｕｍｉｎａｔｅ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎ　Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．　Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，　１８：１６９—１７１．　［１６］魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出　版社，１９７９：５—２０１．　［１７］林永成，周世宁．海洋微生物及其代谢产物［Ｍ］．北　京：化学工业出版社，２００３：４９—４２７．　［１８］　曹理想．植物体内与海洋环境微生物的类群和功能　多样性研究［Ｄ］．广州：中山大学生命科学学院，　２００３：２２—６２．