RAPD在真菌分类鉴定上的应用

RAPD在真菌分类鉴定上的应用

李敏慧1,向梅梅1,2*,姜子德1

(1󰀁华南农业大学资源环境学院,广东广州510642;2󰀁仲恺农业技术学院植保系,广东广州510225)

摘要:对RAPD的原理和特点及其近年来在真菌分类鉴定上的应用进行了综述.内容涉及RAPD在真菌种间、种内,以及种以下分类单元的分类鉴定、疑难种的鉴定和个别菌株的鉴定上的研究进展,并列举了代表性的应用实例.同时对RAPD在真菌分类鉴定上应用的可行性及其在该研究领域中的广阔前景进行了展望.关键词:RAPD;真菌;分类鉴定

中图分类号:S432󰀁4󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码:A

󰀁󰀁长期以来,真菌的分类鉴定一直以形态学性状为主要依据,而这些形态学性状由于难以观察、或在人工培养条件下很难产孢而观察不到、或者本身形态特征相近很难区分,以及易受环境条件的影响而不稳定等原因,给真菌的分类鉴定,尤其是种及种以下的分类鉴定带来了一定的难度

[1]

.

现代分子生物学技术的发展及其在真菌分类鉴定上的应用,为人们从分子水平上分析真菌不同分类单元之间的差异和亲缘关系提供了有力的手段.目前用得较多的是限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)、DNA扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlengthpoly-morphism,AFLP)和内部转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)序列分析技术[1,3],其中RAPD以其所具有的操作简便、速度快、安全(不需要同位素标记)、经济以及仅需要微量模板DNA等优点而深受重视.

据不完全统计,RAPD已在链格孢属(Alternaria),葡萄孢属(Botrytis),发癣菌属(Tri-chophyton),芽枝霉属(Cladosporium),炭疽菌属(Colletotrichum),顶囊壳属(Gaeumannomyces),组织孢浆菌属(Histoplasma),球腔菌属(Mycosphaerella),茎点霉属(Phoma),侧耳属(Pleuro-tus),丝核菌属(Rhizoctonia),腥黑粉菌属(Tilletia)等50余个属的种类区分或疑难种鉴定上得到应用[4~

15]

.而且,新的研究资料仍在增加,研究范围也在不断拓展.尽管已有学者对分子

生物学技术在真菌分类鉴定上的应用进行了综述[1~3],但RAPD在这方面的应用只是其中的一部分内容,而且也不系统.为能将RAPD技术更好地应用到真菌分类鉴定研究的实际工作中,有必要对前人的工作进行更全面的理解和系统的总结.󰀁

收稿日期:2002-05-21

作者简介:李敏慧(1973-),女,内蒙古集宁人,在读硕士研究生.*通讯作者.

󰀁62󰀁仲恺农业技术学院学报第16卷

1󰀁RAPD的原理及特点

1.1󰀁原理

由Williams等[16]和Welsh等[17]于1990年建立的RAPD是一种有效的遗传标记技术,现已广泛应用于动植物及微生物的遗传变异、分子进化和基因组研究等领域.该技术是在PCR技术基础上,利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸链(通常为10bp)为引物,在DNA聚合酶的催化下,以dNTP为原料,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.所得扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色后置于紫外灯光下检测其多态性[18].如果被测基因组在扩增区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,那么扩增产物就增加、缺少而发生分子量的改变.通过一系列引物进行RAPD分析,其探察区域可能覆盖大部分甚至整个基因组,其结果将比较全面地反映被测生物的DNA多态性,从而可以反映生物间的亲缘关系.1.2󰀁特点

RAPD克服了PCR、RFLP的局限性.PCR的双引物必须与模板的已知某一区段的保守序列互补,而且扩增出的多态性有时难以满足某一物种某一水平的系统学分析;RAPD无需模板DNA的任何序列信息,商品化的系列引物可以扩增出足够的多态性以适应种及种下各水平的进化分析;RAPD速度快、成本低,不必象RFLP那样要克隆标记探针,也无需对扩增产物酶切与测序,更无需进行Southern杂交等一系列繁琐程序,因而在较短时间内可分析大量样本,既省时又省力;RAPD多态性灵敏度高,可检测到单个碱基的置换;RAPD不需要使用同位素,可减少对工作人员的危害,因而成为近年来取代RFLP和PCR方法的常用手段.但RAPD的分析结果也受很多相关因子的影响[19],其中以引物、Taq酶、模板DNA浓度、不同的退火温度、以及Mg浓度对扩增效果的影响最大.

2+

2󰀁RAPD在真菌分类鉴定上的应用

RAPD在真菌上主要用于种群变异的研究和种间、种内、生理小种及专化型的区分,也用于真菌的系统学研究.目前国内外关于RAPD在真菌分类鉴定上应用的报道大多集中在以下几个方面.

2.1󰀁RAPD在真菌种级分类鉴定上的应用

Gandeboeuf等[20]于1997年对块菌属(Tuber)中12个分类单位数十个菌株(10个独立种,2个为同一种下的不同变种,其中有几个种形态学上很难鉴定;每个分类单位均有5个以上来自不同国家或地区的菌株)进行了RAPD分析,结果表明,RAPD是分析该属真菌种间遗传变异的有效手段,大多数种类能通过它们扩增的DNA产物进行鉴别;该结果与同工酶分析和核糖体DNA的ITS分析结果相同.Vrioni等[21]对分离自烧伤病人的血液、尿液、唾液和伤口处以及周围环境的40个临床假丝酵母菌(Candidaspp.)菌株进行了RAPD分析,发现任意的引物就可以把他们分为3类,符合之前对这些菌的鉴定结果.在我国,秦国夫等[19]于1996第1期李敏慧,等:RAPD在真菌分类鉴定上的应用󰀁63󰀁

年采用RAPD成功地将中国蜜环菌(Armillariaspp.)生物种分为4个群,并证明了该技术是研究蜜环菌生物种进化关系的有效手段.郑服丛等

[22]

对中国热带地区的柑桔褐腐疫霉

(Phytophthoracitrophthora)和芋疫霉(P.colocasiao)的16个菌株的DNA进行了RAPD分析,结果将供试菌株分为2类,这一点与传统的形态学分类一致,表明RAPD具有属下分种的分类学意义,可用于我国热带疫霉菌的分类鉴定.陈永青等[23]对18种拟茎点霉(Phomopsis)共29个菌株进行了RAPD研究,其结果与形态学分类基本一致,绝大多数的种内不同菌株均以较高的相似性系数聚在一起,而不同的种则只是在较低的水平上相聚,表明应用RAPD进行该属真菌种级水平分类鉴定是可行和合理的.

1995年,Yuan等[24]对两个形态很相似的曲霉菌的种󰀁󰀁󰀁致病曲霉(Aspergillusparasiti-cus)和大豆曲霉(A.sojae)进行了研究,结果表明,3个10碱基随机引物的扩增分析不仅足可将致病曲霉和大豆曲霉的菌株分开,同时还可以将同种的不同菌株分为2个群,并根据RAPD分析和形态学特征,纠正了曾被错误鉴定的两个菌株,认为RAPD技术是区分致病曲霉和大豆曲霉的一个既快速又可靠的手段.1997年,陈伟群等[25]通过对来自中国及亚、非、欧三大洲5个国家的10个烟草赤星病菌(Alternarialongipes)及5个交链孢菌(A.alternata)标准菌株进行了RAPD分析,证明各参试菌株之间相似性很高,并不与寄主和地理来源存在相关性,建议将交链孢菌确定为烟草赤星病菌的学名,并认为RAPD分析结果与形态学研究结论相互比较,可以从遗传本质上加深对研究对象的认识和了解.曾大兴等[26]通过对来自华南的26个香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)菌株以及2个胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)菌株的RAPD分析后,纠正了长期以来认为这两个菌是同种异名的错误,把两者作为独立的种.2002年,黄勃等[27]在对拟青霉(Paecilomycesspp.)的RAPD研究中成功区分了3种在形态上相近的拟青霉,认为RAPD可以作为菌种鉴定的有效手段,表明应用该技术进行疑难种的区分及鉴定是可行的和有效的.

2.2󰀁RAPD在真菌种以下分类单元分类鉴定上的应用

1991年,Crowhurst等[28]采用RAPD分析了腐皮镰刀菌瓜类专化型(Fusariumsolanif.sp.cucurbitae)两个小种的21个分离菌株,将它们分为两个明显的群,同时,还分离到5个具有交配群特异性的DNA探针,认为RAPD是一种快速和可靠的菌株间分离手段.Mesquita等[29]对分离自菜豆上的27个菜豆炭疽菌(C.lindemuthianum)菌株(分属73、65、64号小种)进行了RAPD分析,结果将它们聚为3类,与传统的致病性检测结果一致,同时还找到了鉴定73、65、64号3个小种的特异性引物,纠正了过去错划小种的错误.表明RAPD不仅可作为此种真菌划分小种的可靠辅助手段,而且进一步证明了RAPD可用于病害的快速诊断.Augustin等

[30]

运用RAPD分析了776个来自不同地方、不同寄主的顶囊壳属菌株[分属禾顶囊壳小麦

变种(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici,Ggt),禾顶囊壳燕麦变种(G.graminisvar.avenae,Gga),禾顶囊壳禾变种(G.graminisvar.graminis,Ggg)和柱孢顶囊壳(G.cylindrosporus,Gc)],将它们分为明显的4个群,分别与Ggt、Gga、Ggg3个变种和Gc种相对应.这一结果与形态学分类、致病性检测,以及其它分子生物学手段如RFLP、ITS序列分析结果基本一致.除此以外,在变种Ggt下又可以分为两个亚群,此结果与前人对此变种的研究结果相似.这表明RAPD对此真菌的变种及变种内的分类具有重要意义,与之前的研究方法相比,RAPD又󰀁64󰀁仲恺农业技术学院学报第16卷

是一种快速、简便的分类手段.在我国,朴春根等[31]在对小麦条锈病菌(Pucciniastriiformis)生理小种的RAPD研究中将供试的6个生理小种在致病性方面分成两类,认为此法可以充分反应各小种的遗传异质性.王莉梅等[32]运用RAPD对我国北方棉区黄萎病菌(Verticilliumdahliae)34个菌株进行分类鉴定,发现26个菌株为落叶型菌系,6个菌株为非落叶型菌系.这一结果与致病性检测结果相同.冯洁等

[33]

对我国11个省区的棉花枯萎病菌(Fusarium

oxysporumf.sp.vasinfectum)3个生理小种的26个代表菌株及国外的3个不同生理小种菌株进行RAPD分析后,把供试菌株聚为6组,确定了不同小种间的亲缘关系.在对我国3、7、8号小种的归类上与致病性检测的结果基本一致,从而证明利用RAPD鉴定我国棉花枯萎病菌不同生理小种是行之有效的.

2.3󰀁RAPD在菌株快速鉴别及病害诊断上的应用

Manulis等[34]运用RAPD对分离自康乃馨的58个尖孢镰刀菌菌株进行分析后,认为RAPD是鉴别尖孢镰刀菌石竹专化型(Fusariumoxysporumf.sp.dianthi)的一种简便、快速且重复性好的方法.Zimand等[35]运用RAPD对来自不同地理区域的47个木霉(Trichodermaspp.)菌株进行了分析,筛选出几个引物可以从众多菌株中鉴别出T39这个最早被应用于生防的木霉菌株,并认为RAPD不仅为木霉的分类提供一个很好的方法,而且还可以用来鉴别个别菌株.Crowhurst等

[36]

采用RAPD成功地从众多腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和尖孢镰刀

菌(Fusariumoxysporum)菌株中鉴定出分离自Angsana的尖孢镰刀菌.因为来自Angsana的尖孢镰刀菌的38个菌株表现出普遍的基因同质性,RAPD扩增图谱得到的带型完全相同,很容易同其它菌株区分开来.Zhang等

[37]

对35个分离自烟草的引起烟草黑胫病症状的菌株[28

个致病疫霉烟草变种(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae),4个腐皮镰刀菌(Fussriumsolani),3个基生根串株霉(Thielaviopsisbasicola)]进行了RAPD分析,成功地筛选到10个引物,可以将致病的致病疫霉烟草变种菌株与不致病的菌株以及其它两种引起相同症状的病菌区分开来,RAPD分析结果还显示与致病性检测100%的相关性,从而证明了RAPD可用于烟草黑胫病的快速诊断.在我国,秦敏等[38]采用RAPD对3株典型的稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)菌株进行了分析,证明RAPD可用于稻瘟病菌生理小种的快速鉴别.综上所述,RAPD完全可用于菌株的快速鉴别以及相对应的病害诊断.

3󰀁结语

RAPD是建立在PCR技术基础上的一项分子生物学技术,它继承了PCR的优点,但同时也保留了PCR所固有的缺陷.RAPD对环境敏感,模板DNA质量、不同的扩增条件、甚至不同的操作者,都可能会影响扩增的结果,或是产生假带或是不能获得有效的扩增,这些非正常结果虽然可以通过重复实验加以排除,但对于大量样品的检测,重复实验则带来一定的麻烦.为了克服此缺陷,许多学者也曾进行过深入细致的研究,结果表明,若严格控制模板质量和用量及其它反应体系成分和扩增程序,所得到的RAPD分析结果不仅可以重复还可以在不同的实验室被转用景.

[39]

,这表明该技术在真菌分类鉴定上的应用既可行,也具有广阔前

第1期李敏慧,等:RAPD在真菌分类鉴定上的应用󰀁65󰀁

随着RAPD技术的逐渐完善,其在真菌分类鉴定上的应用将日趋成熟.如果把菌株的快速鉴别应用到病害的早期诊断,即进一步用这些引物对同种内的更多菌株进行RAPD分析,极有可能会找到用于鉴别或检测这些真菌的特异性引物,从而找到快速诊断真菌病害的简便方法,为真菌病害的研究与控制提供可靠依据.

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ApplicationofRAPDanalysisinclassificationand

identificationoffungi

LIMin-hui1,XIANGMe-imei1,2,JIANGZ-ide1

(1.CollegeofResourcesandEnvironment,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China;

2.DepartmentofPlantProtection,ZhongkaiAgrotechnicalCollege,Guangzhou510225,China)

Abstract:TheprincipleofRAPDtechniqueanditsapplicationinclassificationandidentificationoffungi,includingrecentresearchonclassificationofintraspeciesandinterspecies,identificationofsomesimilarspeciesandisolateswerebrieflyreviewed,andsomerepresentativeexamplesweretakenforfur-therillustration.ItindicatedthattheRAPDtechnologywasasimpleandrapidmethodthatcouldbewidelyappliedinthisfield.

Keyword:RAPDanalysis;fungi;classificationandidentification

󰀁责任编辑󰀁冯元璋󰀁

(上接第39页)

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Identificationofthepathogenofbacterium-leafspotindragon

FENGYan,L󰀁L-imei,SHENJia-yi

(DepartmentofPlantProtection,ZhongkaiAgrotechnicalCollege,Guangzhou510225,China)

Abstract:AleafspotcausedbybacteriumonYuccawasfoundinGuangzhouandtheneighbouringcities.Accordingtotheresultsofpathogenicityevaluation,Gram󰀁sstaining,mastisetastaining,andmor-phological,cultural,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsoffiveisolates,thepathogenwasPseudomonascichorii(Swingle)Stapp1982.Thiswasthefirstreportonthediseaseatdomestic.Keywords:Yuccafilamentosa;bacterium-leafspot;Pseudomonascichorii;evaluation

󰀁责任编辑󰀁冯元璋󰀁