341··
·论著·妊娠滋养细胞疾病组织中HIF-1琢、VEGF的表达及临床意义
陈光雪，孙丽芳，刘惠宁
【摘
要】目的：检测缺氧诱导因子1琢（HIF-1琢）和血管内皮生长因子（VEGF）在正常早孕绒毛、葡萄胎和妊娠滋
养细胞肿瘤（GTN）组织中的表达情况，并探究其临床意义。方法：收集正常早孕绒毛组织20例（正常早孕绒毛组）、葡萄胎组织35例（葡萄胎组）和GTN组织28例[包括侵蚀性葡萄胎组织14例（侵蚀性葡萄胎组），绒毛膜癌组织14例（绒毛膜癌组）]。采用免疫组化法检测各组织样本中HIF-1琢和VEGF的蛋白表达情况。分析GTN患者不同年龄及FIGO分期组织中HIF-1琢和VEGF表达的情况。分析GTN组织样本中HIF-1琢和VEGF表达的关系。结果：正常早孕绒毛组与葡萄胎组HIF-1琢和VEGF蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；正常早孕绒毛组HIF-1琢和膜癌组HIF-1琢和VEGF蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。GTN患者FIGO芋+郁期组HIF-1琢蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。HIF-1琢与VEGF在GTN组织中的表达呈正相关（rs=0.995，
【关键词】妊娠滋养细胞肿瘤；绒毛膜绒毛；缺氧诱导因子1，琢亚基；血管内皮生长因子类；免疫组织化学TheExpressionandClinicalSignificanceofHIF-1琢andVEGFintheTissuesofGestationalTrophoblasticDiseaseCHENGuang-xue袁SUNLi-fang袁LIUHui-ning.DepartmentofObstetricsandGynecology袁BeijingJishuitanHospital袁Beijing100035袁China渊CHENGuang-xue袁SUNLi-fang冤曰DepartmentofObstetricsandGynecology袁XiangYaHospitalCentralSouthUniversity袁Changsha410008袁China渊LIUHui-ning冤
Correspondingauthor院LIUHui-ning袁E-mail院h23564@126.com揖Abstract铱Objective院TodetecttheexpressionofHIF-1琢andVEGFinthetissuesofnormalpregnancyvilli,和VEGF蛋白表达的阳性率高于玉+域期组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；而不同年龄GTN患者HIF-1琢和VEGFVEGF蛋白表达的阳性率低于侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；侵蚀性葡萄胎组和绒毛
P=0.000）。结论：HIF-1琢及VEGF可能在GTN发生和恶性进展过程中发挥协同作用。
normalpregnancyvilli(normalpregnancyvilligroup),35casesofhydatidiformmoles(hydatidiformmolesgroup),28casesofgroup)]werecollected.TheproteinexpressionofHIF-1琢andVEGFinthetissuesweredetectedbytheimmunohistochemistryassay.TheexpressionofHIF-1琢andVEGFindifferentage,FIGOstageofGTNpatientswereanalyzed.ThecorrelationbetweenHIF-1琢andVEGFexpressioninGTNtissuesampleswasanalyzed.Results院TherewasnosignificantdifferenceinthepositiveThepositiveratesofHIF-1琢andVEGFinthenormalpregnancyvilligroupandhydatidiformmolegroupweremuchlowerthanGTNtissues[concluding14casesofinvasivemoles(invasivemolesgroup)and14casesofchoriocarcinoma(choriocarcinoma
hydatidiformmolesandgestationaltrophoblasticneoplasm(GTN),andtoexploretheclinicalsignificance.Methods院20casesof
rateofHIF-1琢andVEGFproteinbetweenthenormalearlypregnancyvilligroupandthehydatidiformmolegroup(P＞0.05).thoseintheinvasivehydatidiformmolegroupandchoriocarcinomagroup(P＜0.05).Moreover,therewasnodifferenceinthe
作者单位：100035北京积水潭医院妇产科（陈光雪，孙丽芳）；中南大学湘雅医院妇产科（刘惠宁）h23564@126.com通信作者：刘惠宁，E-mail：
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（收稿日期：2018-01-25）
[本文编辑王琳]
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国际妇产科学杂志2018年6月第45卷第3期JIntObstetGynecol，June2018，Vol.45，No.3
theexpressionofHIF-1琢andVEGFwerecorrelatedwiththeFIGOstages(P＜0.05),butwerenotcorrelatedwiththeage(P＞1琢andVEGFmayplayasynergisticroleintheoccurrenceandmalignantprogressionofGTN.positiveratesofHIF-1琢andVEGFbetweentheinvasivemolesgroupandchoriocarcinomagroup(P＞0.05).IntheGTNtissues,
0.05).TheexpressionofHIF-1琢andVEGFwerepositivelyrelatedintheGTNtissues(rs=0.995,P=0.000).Conclusions院HIF-揖Keywords铱Gestationaltrophoblasticneoplasms曰Chorionicvilli曰Hypoxia-induciblefactor1袁alphasubunit曰Vascular
endothelialgrowthfactors曰Immunohistochemistry
disease妊娠滋养细胞疾病（gestationaltrophoblastic
的一组，妊娠GTD）相关是源于疾病胎盘滋养[1]，包括葡萄层上胎皮（细胞异部分性常增和完全殖性葡萄胎）、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌、上皮样滋养细
胞肿瘤和胎盘部位滋养细胞肿瘤[2]，除部分性葡萄胎和完全性葡萄胎外，均为恶性疾病，又统称为妊娠滋养细胞肿瘤（gestationaltrophoblasticneoplasm，GTN）[3]
。葡萄胎为良性病变，但具有恶变的潜能，约4%部分性葡萄胎和20%完全性葡萄胎可恶变为GTN[4]
。GTD严重威胁女性的生命健康，然而其发病机制尚不清楚，尚无可靠的预测转移及预后的靶标分子，故寻找可靠的预测GTD发生、发展的靶标分子成为当前的研究热点。
HIF-1缺氧诱导因子1琢（hypoxia-induciblefactor-1琢，
通过调节琢）是growthfactor血肿瘤，管VEGF内适皮应）生缺的长氧表达因环境的重要调子诱（导vascular控肿瘤血endothelial蛋白，可HIF-1管生成，
用的研究琢与已VEGF成为热在点促[5]进。本肿瘤研究通过生长、侵免疫组袭和转化移法中作检测正常早孕绒毛及不同GTD组织中HIF-1琢和VEGF的蛋白表达情况，探讨HIF-1琢和VEGF在GTD的发生发展以及侵袭转移过程中可能发挥的作用，以期为GTD发病机制的研究及综合治疗提供新的思路及理论依据。1
材料与方法
1.1
病例资料
2010年5—6月收集因社会或个人因素在
中南大学湘雅医院门诊行人工流产患者的正常早孕绒毛20例正常早孕绒毛组），患者年龄19耀39岁，中位年龄28（24，32）岁。纳入标准：妊娠早期（妊娠6耀8周），无异常妊娠史，无内外科合1995并症年，刮5月宫—前2010均未接年受12任何月收药物治疗集北京积，无水感潭染医院性疾病。大学湘雅医院的GTD患者的组织石蜡存档标本共63例、。中其
南
中葡萄胎标本35例（葡萄胎组），患者年龄19耀50岁，中位年龄26（20，32）岁；侵蚀性葡萄胎标本14例（侵蚀性葡萄胎组），肿瘤分期参照国际妇产联盟（FIGO）的分期标准，玉期10例、域期1例、芋期3例、郁期0例，患者年龄24耀54岁，中
渊JIntObstetGynecol袁2018,45院341-345冤
位年龄44（37，51）岁；绒毛膜癌样本14例（绒毛膜癌组），玉期6例、域期2例、芋期4例、郁期2例，患者年龄20耀57岁，中位年龄32（27，37）岁。葡萄胎标本为首次清宫标本，侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌标本为首次清宫或手术标本（宫腔镜检、子宫全切）。纳入标准：所有病例均经病理确诊，术前均未接受化疗，具有完整的临床及病理资料。1.2
试剂与仪器
即用型兔抗人HIF-1琢多克隆抗体购自
武汉博士德医疗有限公司，即用型兔抗人VEGF多克隆抗体购自北京中杉金桥医疗有限公司，鼠抗兔二抗、DAB显色试剂盒和SP免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。
恒温水浴锅（英国Grant公司），普通冰箱（中国海尔公司），微波炉（广东格兰仕公司），石蜡切片机（德国LEICA公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司），普通高压锅（青岛海尔有限公司），显微摄像系统（BX41，日本OLYMPUS公司）。1.3
免疫组化法检测HIF-1琢及VEGF
所有组织经10%
中性福尔马林固定，石蜡包埋，5滋m厚连续切片。脱蜡和水化后蒸馏水漂洗2次，2min/次；3%H2漂洗2次，2min/次；切片置于枸橼酸盐O2处理10min，蒸馏水
缓冲液（0.01mol/L，醇pH溶值液=6.0室温），孵微育波炉10内min加，热，磷酸抗原盐修缓复冲液10（耀PBS15min）洗，3%2次H2，2O2min/-甲次1琢；和1%VEGFBSA封闭液，室温下封闭20耀30min；分别滴加HIF-PBS-T溶液洗一2抗次工，作2min/液（次稀；滴释加比鼠例抗1颐兔100二抗），4（益稀孵释育比过例夜1，150），37益孵育30min，PBS-T溶液洗2次，2min/次；滴加SP颐液，37益孵育30min，PBS-T溶液洗2次，2min/次；DAB显色剂，室温孵育5耀10min，蒸馏水漂洗干净；苏木素复染，蒸馏水冲洗返蓝，脱水透明，中性树胶封片。以PBS替代一抗作阴性对照，HIF-1琢阳性表达的肺腺癌组织、VEGF阳性表达的乳腺导细胞质HIF-1管癌或细胞琢组蛋白织作膜。主阳显要定性对微镜位照高于。
倍细胞质，镜（伊400VEGF）下随蛋白机选择主要定5位个于视野，每个视野观察100个细胞。染色程度评分，0分：无着色，1分：淡黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色。阳性细胞百分数评分，0分：小于5%，1分：5%耀25%，2分：26%耀50%，3分：51%耀
75%百分，数4分评：分之大于和75%，＜2。分为染色阴指性数（为-）染，2色耀3程分为度评弱分阳与性阳（性细胞+），4耀5分为中度阳性（++），逸6分为强阳性（+++），弱阳性、中度阳性、强阳性均做阳性统计。结果评分由两位经验丰富的病理医师协助完成。
（国际妇产科学杂志2018年6月第45卷第3期JIntObstetGynecol，June2018，Vol.45，No.3
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1.4统计学方法数据资料采用SPSS19.0软件进行统计分
析。定性资料比较采用卡方检验，n＜40时采用Fisher忆s确切概率法。定性资料之间的相关性分析采用Spearman等级相关。P＜0.05为差异有统计学意义。
0.000）；葡萄胎组HIF-1琢蛋白表达的阳性率低于侵
蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组（P=0.001，P=0.000）；而侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组HIF-1琢蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P=0.622）。
表1
组别正常早孕绒毛组葡萄胎组侵蚀性葡萄胎组绒毛膜癌组
2
2.14组患者HIF-1琢染色指数和阳性率比较4组1。正常早孕绒毛组与葡萄胎组HIF-1琢蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P=0.080）；正常早孕绒毛组HIF-1琢蛋白表达的阳性率低于侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组，差异有统计学意义（均P=患者HIF-1琢蛋白染色指数和免疫组化图见表1，图
结果
4组患者HIF-1琢染色指数和阳性率比较
n20351414
-+1566HIF-1琢++0433
+++0123
[例（%）]*阳性率192532
1（5.00）
10（28.57）11（78.57）12（85.71）
注：*采用Fisher忆s确切概率法比较阳性率。
HIF-1琢
VEGF
正常早孕绒毛葡萄胎侵蚀性葡萄胎绒毛膜癌
图14组患者HIF-1琢、VEGF蛋白在绒毛组织中的免疫组化图（免疫组化染色伊400）
2.2
HIF-1琢染色指数和阳性率比较
GTN患者不同年龄和不同FIGO分期的
GTN患者共28
性率比较，差异无统计学意义（P=0.356）；正常早孕绒毛组VEGF蛋白表达的阳性率低于侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组，差异有统计学意义（P=0.013，P=0.003）；葡萄胎组VEGF蛋白表达的阳性率低于侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组（P=0.030，P=0.009）；而侵蚀性葡萄胎组和绒毛膜癌组VEGF蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P=0.663）。
表3
组别
1。正常早孕绒毛组与葡萄胎组VEGF蛋白表达的阳
例。GTN患者FIGO芋+郁期组HIF-1琢蛋白表达的阳性率高于与玉+域期组，差异有统计学意义（P=0.029）；而不同年龄GTN患者HIF-1琢蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P=0.673），见表2。
表2
GTN患者不同年龄和不同FIGO分期的HIF-1琢
染色指数和阳性率比较
组别年龄＜40岁FIGO分期逸40岁
161219n
-415
+938HIF-1琢++154
+++232
[例（%）]12（75.00）11（91.67）14（73.68）
0.029
阳性率P*
4组患者VEGF染色指数和阳性率比较
n20351414
-+3655VEGF++1423
+++1333
[例（%）]*阳性率0.673
正常早孕绒毛组葡萄胎组侵蚀性葡萄胎组绒毛膜癌组
152243
5（25.00）
13（37.14）10（71.43）11（78.57）
玉+域期
芋+郁期904239（100.00）注：*采用Fisher忆s确切概率法比较阳性率。
注：*Fisher忆s确切概率法。
2.34组患者VEGF染色指数和阳性率比较4组
2.4
患者VEGF蛋白染色指数和免疫组化图见表3，图
郁期组VEGF蛋白表达的阳性率高于与玉+域期组，
VEGF染色指数和阳性率比较
GTN患者不同年龄和不同FIGO分期的
GTN患者FIGO芋+
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差异有统计学意义（P=0.026）；而不同年龄GTN患者VEGF蛋白表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P=0.717），见表4。
表4
GTN患者不同年龄和不同FIGO分期的VEGF染色
指数和阳性率比较
组别n
年龄-+VEGF+++++[阳例（性%率）]P*
＜40岁16581211（68.75）0.717
FIGO逸40分期岁
12224410（83.33）玉芋+域期
197
81
3
12（63.16）
0.026
注：+*郁Fisher期忆s确9切概率0法。
2439（100.00）2.5GTN组织中HIF-1琢与VEGF表达的相关性分20析
1琢例与，均GTNVEGF阴性组在者织GTN4中例HIF-1，组Spearman琢与VEGF织中的相关表达分表达呈析表均正相关明阳，HIF-性者
0.995（rs=
表5
，P=GTN0.000组）织，中见HIF-1表5。
琢与VEGF表达的相关性分析
（例）
HIF-1琢VEGFrsP--4+++0.9950.000++++++
211
70+++10020321043讨论
肿瘤的形成和恶性进展过程中，肿瘤组织的生
长速度超过肿瘤血管供氧速度，势必会造成局部组织缺氧，故肿瘤细胞微环境缺氧是实体肿瘤快速生长的共同特征。Kieran等[6]提出“肿瘤依赖血管形成”学说，成，其HIF-1即肿瘤中HIF-1是一种细胞的生长依赖于新生血管的形成。
琢是DNA决定结HIF-1合蛋白，活性的由琢和氧调节茁亚基亚构
单位[7]。缺氧是促进HIF-1琢过量表达的重要影响因素，常氧条件下HIF-1琢经泛素化途径降解，而在低氧环境下其降解过程受抑制，HIF-1琢蛋白迅速累积，并与HIF-1茁聚合，形成有活性的HIF-1蛋白，调节下游靶基因的转录[8]。HIF-1琢是唯一能在低氧HIF-1条件下琢仍在具有人正常组转录织活性的特异性蛋白调节中基本不表达，而在大多因数子。瘤组织中过量表达[9-10]。在缺氧微环境下，肿瘤细胞肿高表达HIF-1琢，通过调节细胞能量代谢、血管新生、
肿瘤转移等途径诱导肿瘤细胞发生适应性改变[11]。
恶性肿瘤组织可分泌多种促血管生成因子，参与肿瘤性血管生成，如成纤维细胞生长因子和促血管生成素等[12]，其中VEGF是作用最强、特异性最高的促血管生成因子，可通过和血管内皮细胞的特异性受体结合发挥强大的促内皮细胞的增殖、促进血管生成作用，肿瘤细胞高表达VEGF，血管生成加速，促进肿瘤的侵袭和转移[13]为VEGF的表达受多种因素。
的调控1胞琢止所耐通过发现的受缺增氧加最强的调节因子。缺氧状态下，缺氧是，HIF-迄今
能其力下，游且靶增基因加供氧VEGF和供能表达，从而，增强肿瘤促进肿瘤细细胞生长、浸润和转移。可见HIF-1琢及VEGF与肿瘤1琢的发和本VEGF生、进展密切相关[14]研究结在果GTD。目前，国内外关于HIF-发现，中的HIF-1表达琢罕和有VEGF报道。
蛋白在正常
早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌组织标本中的阳性表达率呈逐渐增高趋势，此外，在侵蚀性葡萄胎及绒毛膜癌组织中，HIF-1琢和VEGF的表达都明显高于正常早孕绒毛组织及葡萄胎组织，侵袭性葡萄胎和绒毛膜癌均为恶性肿瘤，其中以绒毛膜癌恶性程度最高，早期就可以通过血行转移至全身，破坏组织器官，引起出血与坏死[15]。以上研究结果提示，HIF-1琢和VEGF在GTD中普遍表达，并且随疾病的VEGF恶性程度增高，其表达水平升高得也为可进能一促步进探讨了GTNHIF-1的琢生和长VEGF及恶性在行GTN为。
更为显著，中表达
的临床意义，本研究分析了HIF-1琢和VEGF表达与GTN患者年龄、FIGO分期的关系。结果显示，临床玉分期患、者域的病期芋者、变范，郁根期围据者仅FIGOHIF-1局限临床琢于生分期标和VEGF殖器官准表达水平高于，而，玉临床、域分期期GTN郁期患者则出现肺化部越或其差，增他殖组越快织器官，肿瘤的转细胞移。通芋需分常
、认为肿瘤细胞分泌更多的血管形成因子，以便形成丰富的肿瘤营养血管，为肿瘤的生长提供源源不断的营养。本研究结果提示，在GTN中HIF-1琢和VEGF表达水平越高，肿瘤恶性程度可能越高，发生深肌层浸润、发生血行转移的可能性越大。因此，HIF-1琢和VEGF有可能成为预测GTN远处转移及预后的参考指标。在GTN组织中HIF-琢与VEGF表达呈正相关
（rs同参与=0.995了，GTDP=0.000的疾病）。推恶测性HIF-1进展、GTN琢和的VEGF形成发可能展共过程。有研究证实，HIF-1琢可以与VEGF启动子结合，
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增加VEGF及其受体的表达，诱导肿瘤生成更多的血管[16]，后续研究中，将深入探索HIF-1琢与VEGF之间的具体作用机制。
综上所述，本研究结果发现，HIF-1琢和VEGF蛋白在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌组织标本中的阳性表达率逐渐增高，且在GTN组织中，HIF-1琢和VEGF表达之间呈正相关，提示在HIF-1琢及VEGF在GTN中的发生和恶性进展过程中发挥协同作用，HIF-1琢及VEGF具有作为GTN分子靶标的潜能。本研究样本数量有限，今后需扩大样本对本研究结论进行论证。
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[本文编辑王琳]
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