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相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价

来源:小奈知识网
Med.Sen.2010.Vo1.19.No.9 存在,而且糖尿病的病情与自身抗体异常程度一致;这 自身抗体的意义不仪是区分糖尿病的类 ,也反映r病 人免疫功能的异常及机体对胰岛素的不敏感和/或效力 减低。 [2】王话兰.量子医学 } 临床诊断及研究中的进展【J1中 斟医师杂志,2004,6(3):289—291 f 3 1张海涛量子医学与健康革命.青岛全圜量子医学筹 备研讨会文献汇编『G].2006:16—1 7. I4 1刘幼硕.老年人糖尿病的诊断及治疗要点f J].中华老 年医学杂志,2005,24(10):796—800. f5】夏燕萍,俞茂华,陈刚,等.老年精尿病患者胰岛细胞 自身免疫分析lJ】中华老年医学杂志,2008,27(I): 27—28. 由于该阶段的异常指标可受多种因素的影响,其发 展趋势会有所不同。一般可演变为:一是不良刺激反复作 用,疾病从无症状到有症状,至临J术阶段或慢性病阶段; 二是通过调理或相应的干预措施,可转为正常; 足停留 在某阶段呈蛰伏状。因此对异常指标患者做针对性的预 防措施,做到疾病的早发现、早治疗、 预防,对减少疾病 及慢性并发症的进一步发生发展有重要意义。 【6】杨琳,周智广,黄} ,等.四种映岛自身抗体诊断成人 隐匿性自身免疫性搪尿病的临床意义[J]中华内分泌 代谢杂志,2005,21(4):327—330. 【7]萧建中,畅兆军,王金 ,等“2型糖尿病”患者胰岛 参考文献: I】]张旭良,骆健.量子医学与量子 振仪QRA[J].医学设 细胞抗体榆测的意义[J] 中华内分泌代谢杂志,2005, 21 f 5):438—440. 备信息,1999,1:54. f收稿日期:2009—12-251 文章编号:1005—619X(2010)09—0840—03 相思子毒素双抗夹 D ELISA检测方法的建立与评价 266071济南军区青岛第二疗养院张立营孙英姿 赵怀龙傅兴伦 250014济南军区联勤部疾病预防控制巾心【摘要】目的建立相思子毒素双抗夹心ELISA 测方法并进行方法学评价:方法优化最佳相思子毒素多抗包被浓度后 建立了相思子毒素双抗夹心ELISA捡测方法,鉴定其检测灵敏度、线性范围、特异性、重复性、回收率等 结果双抗夹心 ELISA方法检测相思子毒素的最小栓出限为1 ng/mL,标准曲线在10~1O0・ g/mL范围内线性良好 血清中加入已知量的标 准毒素蛋白,测得平均回收率为89%。结论 本方法检测相思子毒素的可测范围广、特异性强、灵敏度高、变异系数较小,表 明其灵敏、特异、可靠: 【关键词】相思子毒素;双抗体夹心E1 ISA;方法学评价 【Abstract】Objective To establish a double antibody sandwich ELISA method for detection of abrin and analyze the methodology. Melhods Atier the optimal coating concentration of polyclonal antibody of abrin was optimized:a double antibody sandwich ELlSA method was established.Detection sensitivity。linear range,speciifcity,repeatability and recovery rate were assayed Results The mini— ealr detection limit of abrin was J ng/mL and the linearity of standard curve was fine in the range of 10 to 100 ng/mL.The average recovery was 89%when the known amounts of standard toxin protein was added into blood samples.Conclusion This method for detection of abrin is sensitive,speciic and rfeliable because of its wide measure range,high sensitivity,good speciicifty,small coeffi- cient of variability. 【Key words】Abrin;Double antibody sandwich ELISA;Methodological evaluation 相思子毒素fabrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白,与蓖麻毒素(ricin)同为Ⅱ 型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员,是迄今为止所发现的毒 性最强的植物毒素之一,毒性是普通化学武器的几百倍。 相思子毒素已经成为一个成功的天然毒素战剂 1: 由于相思子毒素天然资源比较丰富,制备比较容易, 并且相思子毒素中毒后无特异症状,f¨现症状时已经造 成机体严重的器质损害,具备生物毒素武器典 特征, 此历来为外军所高度重视l11。在2001年世界生物及毒素武 器大会(BTWC) ̄,相思子毒素再次被列入重点核查清单。 因此,无论是从核查、应用治疗,还是从防护日的,开展对 相思子毒素的研究具有十分重要的意义 1。 本研究利用相思子毒素的多抗和单抗建立相思子毒 1.1 材料相思子毒素、相思子毒素单抗和多抗南本实 验室保存,HRP标记的羊抗鼠抗体购自北京华美公司。 1.2 检测过程 ①样品稀释:将相思子毒素进行如下稀 释,1 ghnL、100 ng/mL、10 ng/ml 、1 ng/mI 、100 pg/mL、 10 DghnL、0 g/mL。②包被:加入包被液稀释的相思子毒素 多抗f1:1 000稀释),1O0 L/孑L,4℃过夜。甩干包被 液,PBST缓冲液洗涤液洗涤3次,3 rain/次。③封闭:加入 1%BSA封闭液,l 0(】 L/孔,37℃60 min,甩干;PBST洗 涤液洗涤3次.3 min/次 ④加样:加入相思子毒素蛋白, 100 L/孔,每个样品苇复3个孔,同时设阳性对照、阴性 样品和空白对照,37 qc 60 min甩干液体,洗涤液洗涤3次, 3 min/次。⑤加相思子毒素单抗(1:4 000稀释):100 L/孔。 37℃60 min甩干液体,洗涤液洗涤3次,3 min/次。⑥每孔加 素的双抗夹心ELISA检测方法,并对检测方法进行了方法 学评价。本方法对建立相思子毒素检测试剂盒具有重要 的现实意义与应用价值。 1 材料与方法 入100 L辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(1:5 000), 37℃恒温0.5 h,洗板3次(同前),每孔加入100 L底物溶 液显色15 min,加入2.0 mol/L H2SO 100 L终止反应,于 酶标仪上读取450 nm吸收波长处的OD值。⑦结果判断: 基金项目:青岛市公共领域科技支撑计划项目(09—1—1—28一nsh) 生围 鲞医堂 旦箜! 鲞整 5导 一3;『 ●0 0 0 0 0 0 ・841・ lAP(待测样本OD值) 阴性样本OD值)大于2.1判为阳性。 2 结果 2.2检测方法的灵敏度和线性范围的确定 将相思子 毒素进行梯度稀释,在优化的实验条件下,采用以上双 2.1 相思子毒素多抗包被浓度的确定 包被不同浓度 抗体夹心ELISA法测定相思子毒素。得出双抗体夹心 ELISA法测定相思子毒素的检m限为1 ng/mI 。当相思子 毒素的浓度在10~1O0 nghnL范围时,相思子毒素浓度与 吸光度之间呈线性关系,线性回归方程为y=O.049x+0.407 f即A=0.407C+0.049),线性相关系数r-=0.997 6。在此浓度 相思子毒素多抗的酶标板,在相同条件下进行间接 EI ISA实验,结果(图1)。当相思子毒素多抗的包被浓度 在1.0~50.0 g/mL范围时,0D 值呈上升趋势;浓度高 于50.0 g/mLN ̄,OD 值趋于饱和,故相思子毒素多抗的 最佳包被浓度为50.0 g/mL。 厂— 范围内,相思子毒素可进行定量分析。 2.3检测方法的特异性分析用优化的检测体系分别检 测相思子毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素,以验证该检测体 ////一一 系的特异性。结果表明,检测相思子毒素时,随着相思子毒 素浓度增加,OD 值呈增加趋势:而检测相思子毒素和蒴 莲根毒素时,OD4 ̄:值与相思子毒素浓度为零时的0D 值接 近,表明该方法对相思子毒素具有很好的特异性。 2.4 检测方法的重复性分析 采川变异系数表示法,在 2—Lr一一一0 一20 4f) 6f)一80  1(X) 同一次测定巾对3个浓度水平的样品分别重复测定3次计 算批内变异系数。分别测定3个浓度水平的样品在3个不 同批次测定之间的变异系数(批间变异系数),结果(表1)。 表1重复性测定结果 多抗包破浓度(ing/l ) 注: 为平均值,s为标准差,cv为变异系数 2.5 回收率的分析 向血液样品巾分别添加5、10、 20 ng/mLfl ̄J相思子毒素,每个浓度做3个平行,同时做3个 空白对照,测定相思子毒素含量,计算回收率,结果(表2)。 表2回收率测定结果 3 讨论 成年人摄入的致死剂量为5.0~7.0 g,其毒性强度是 相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrus precato— 蓖麻毒素(小鼠LD 3.0 g,kg)的70多倍,已被列为潜在 的重要毒素战剂和生物恐怖病原物质之一【”1。 目前检测相思子毒素的方法通常有免疫分析法和生 lfus)的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素,其含 量约占种子2.8%~3.O%。相思子毒素存在4种同族毒素 (isoabrins),即ahtin—a、abrin—b、abrin—C、和abrin—d,相对分子 物质谱法。生物质谱法需要使用昂贵的基质辅助激光解 吸电离质谱或电喷雾质谱,目前普及还较困难。而免疫分 析法具有灵敏度高、便于检测生物样品等优点。其中,酶 联免疫技术由于操作简便、方法快速、仪器相对简单等优 点应用日益广泛{8 1o1。 质量介于63~67 ku之间,它们由不同的基因所编码,但 同属于一个多基因家族;其中abrin—b、abrin—c由于其B链 凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用;而abrin—a、 abrin—d则有极强的细胞毒性,小鼠的LD 为0.04 gag, ・842・ 2010 Vo1.19、No.9 本研究利用相思子毒素的单抗和多抗建立了相思子 毒素的双抗夹 C'ELISA检测方法,能在几小时内检测几十 到上百个样品,且不需要复杂的仪器设备,样品预处理简 [5】李丽琴,郑晓军,陈乐贵,等.相思子毒素多克隆抗体 研究【J】.防化研究,2001(4):19—21. [6]Zemla AT,Ecale Zhou CL.Structural re—alignment in an immunogenic surface region of ricin A chain[J】.Bioinform Biol lnsights,2008(2):5-13. 单,检测成本低,检测结果准确可靠,在现场监控和基层 检测中有着广阔的推广应用前景。 参考文献: [1】马惠海,罗胜军,王哲,等.相思子毒素研究进展【J]. 动物医学进展,2006,27(9):5O一54. [71 Zhou H,Zhou B,Ma H,et a1.Selection and eharacteriza— tion of human monoclonal antibodies against Abrin hy phage display[J].Bioorg Med Chem Lett,2007,17(2O):5690—5692. [8]唐伟国.医学检验诊断试剂的制备与应用[M】.上海: 上海科学技术文献出版社.1996:12—14. [9]Lin JY,Lee TC, Fung TC.1so/alion of antitumor proteins abrin—Aand abrin-B from Abms preeatorius[J】.Int J PeN Protein Res,1998,12(5):311—317. [2】李小兵,谢光洪,周昌芳,等.相思子毒素2a的纯化及 鉴定[J].中国兽医学报,2008,28(3):310—313. f 3】Bhaskar AS,Deb U ,Kumar O,et a1.Ab6n induced oxida— tive stress mediated DNA damage in human leukemic ceils [10]Hedge R,Maiti TK,Podder SK.Purification and character— and its reversal by N—aretykysteine[J].Toxicol In Vitro, 2008,22(8):1902—1908. rization of three toxins and two agglutinins from abms pre— catorius seed by using lactamyl—sepharose afifnity。hm— 【4]Gather EA.Toxicity and detection of ahrin and ahrin in beverages[J].J Food Prot,2008,71(9):1875—1883. matography[J].Analytical biochemistry,199l,194(1):101-109. f收稿日期:2010—05—25) 文章编号:1005—619X(2010)09—0842—02 便携式简易人体测量装置的组合创新 510515广州军区广州疗养院【摘要】目的谭莉向忠民郑军 将小型人体磅秤、微量血糖 组合创新一种用于心血管危险评估及筛查的便携式简易人体测量装置。方法血脂仪、电子计算器及分别经过改良的踝肱电子血压计、人体周径测量尺、使用说明、评估卡整装于一个具有拉杆式身高测 量仪的便携箱内,用于基层部队心血管危险筛查。结果该便携式简易人体测量装置设计轻巧,使用方便,对于心血管危险 该便携式简易人体测量装置大大提高了基层部 因素评估及分层可获得与实验及特诊检查后综合评估同样的效果。结论队医疗单位预测评估心血管代谢危险的能力,值得进一步研究推广。 【关键词】便携式;简易人体测量;心血管危险;研制 【Abstract l Objective To innovate a simple and portable human body measuring device and technology for evaluating cardiovascu— lar diseases.Methods The portable human scale,mini blood sugar and blood fat instrument,electronic calculator,manuals as well as improved electric sphygmomanometer for measurement of ankle—brachial index,body—perimeter measurement ruler and manuals assess— ment manual were placed into a box and used in screening for cardiovascular diseases in the basic—level military oficerfs.Results This device is characterized by delicate design and convenient use,which can get the same result as generalized assessment with labo。 ratory test and special detection for the risk assessment and layering of cardiovascular diseases.Gonclusion This device greatly im— proves the ability of the basic—level military hospitals to evaluate the risk of cardiovascular diseases,which is worth for further study and development. 【Key words】Potrable;Simple human body measurement;Risk of cardiovascular diseases;Develop 1 弓I言 2基本组成设计(图1) 随着社会经济的发展和生活方式的转变,心血管疾 病已经成为威胁人们健康的第一大杀手l】1。早期预防和 干预心血管疾病,尤其是心血管代谢危险的发生和发展, 是心血管医学领域研究的重点和热点,也是保证我军担 负军事斗争重要使命的需要。预防、预测心血管疾病及危 险,在医院条件下可采用检验、特诊等医疗手段。近年来 的研究证实,简易人体测量对于心血管代谢危险也能起 到同样的预测评估作用[Zl。基层部队大多驻扎在边远的 区域,急需一种携带方便的人体测量装置及技术组合,根 据这一需要我们在临床实践的基础上研制了一套便携式 简易人体测量装置,现介绍如下。 图1 便携式简易人体测量装置基本组成设计 

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