２０１３年１月 中国比较医学杂志 Ｊａｎｕａｒｙ，２０１３ 第２３卷第１期 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｖｏ１．２３ ＮＯ．１ 大鼠 仙台 病毒ＥＬＩＳＡ、间接免疫荧光和免疫印迹 三种检测方法比较 向志光，佟 巍，李雨函，刘先菊，张丽芳，王艳蓉，魏 强 （中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部实验动物检测中心，北京 １０００２１） 【摘要】 目的 比较ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ・ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＩＦＡ（ｉｍｍｕｎｏ—ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）和ＷＢ （Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）三种方法在大鼠仙台病毒血清学检测中的差异。方法仙台病毒蛋白抗原经凝胶电泳分离转移后 用于血清学检测的ＷＢ方法；使用ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ方法对２Ｏ份无菌大鼠、２２７份ＳＰＦ大鼠以及６３份清洁级大鼠送检血 清样品进行检测，阳性及可疑样品用ＷＢ方法进行了验证。结果２０份无菌大鼠血清样品被３种方法检测为仙台 病毒抗体阴性；ＳＰＦ级大鼠样品被ＩＦＡ方法判定为阴性，１．３２％（３／２２７）被ＥＬＩＳＡ方法判定为阳性，其中有２／３被 ＷＢ确认为阳性；ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ和ＷＢ在清洁级大鼠样品中检出仙台病毒的阳性率分别为为１８．１２％、ｌ１．３４％和 １５．８７％。结论三种检测方法灵敏度从高到低依次为ＥＬＩＳＡ、ＷＢ和ＩＦＡ。ＷＢ方法可作为ＩＦＡ和ＥＬＩＳＡ难以确 定结果的替代方法。 【关键词】仙台病毒；ＥＬＩＳＡ；ＩＦＡ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 【中图分类号】Ｒ３３２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１－７８５６（２０１３）叭－００２３－０４ ｄｏｉ：１０．３９６９．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１．７８５６．２０１３．００１．００６ Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＥＬＩＳＡ．ＩＦＡ ａｎｄ ＷＢ ＸＩＡＮＧ Ｚｈｉ—ｇｕａｎｇ，ＴＯＮＧ Ｗｅｉ，ＬＩ Ｙｕ—ｈａｎ，ＬＩＵ Ｘｉａｎ－ｊｕ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ—ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ—ｒｏｎｇ，ＷＥＩ Ｑｉａｎｇ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｒｉｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ．Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２１，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＥＬＩＳＡ，ＩＦＡ ａｎｄ ＷＢ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｒａｔ ｓｅｒａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅ ＳｅＶ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＷＢ ｍｅｔｈｏｄ；２０ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｇｅｒｍ ｆｒｅｅ ｒａｔｓ，２２７ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ＳＰＦ ｒａｔｓ ａｎｄ ６３ ｓｅｒａ ｆｒｏｍ ｃｌｅａｎ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ，ＩＦＡ，ｔｈｏｓｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＷＢ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ２０ ｇｅｒｍ ｆｒｅｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ＳｅＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｙ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ；ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ＳＰＦ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ＳｅＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｙ ＩＦＡ，ｂｕｔ １．３２％ｏｆ ｔｈｅｓｅ ＳＰＦ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ＳｅＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＥＬＩＳＡ，ａｎｄ ２／ ３ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ＥＬＩＳＡ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒａ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＷＢ；Ｔｈｅ ＳｅＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ｃｌｅａｎ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ １ ８．１ ２％ｂｙ ＥＬＩＳＡ，１ １．３４％ｂｙ ＩＦＡ，ａｎｄ １５．８７％ｂｙ ＷＢ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈｅ—ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｔｏ ｌｏｗ ｉｓ ＥＬＩＳＡ，ＷＢ，ａｎｄ ＩＦＡ．Ａｎｄ ＷＢ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ＳｅＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｏｓｅ ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｉＦＡ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；ＥＬＩＳＡ；ＩＦＡ；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 【基金项目】中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金项目（ＤＷ８２０１２１３）。 ［通讯作者】魏强，Ｅｍａｉｌ：ｗｅｉｑｉａｎｇ０４３０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。 ２４ 中国比较医学杂志２０１３年１月第２３卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏ！．２３．Ｎｏ．１ 我国实验动物国家标准要求对清洁级以上的 啮齿类实验动物进行仙台病毒检测 ，规定的检 测方法包括酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和免疫荧 光试验（ＩＦＡ）等 。两种方法分别以吸光度和荧 光强度显示特异性抗原抗体反应，本质相似。然 而在实际应用中部分样品由于存在非特异结合， 导致使用单一方法难以对这类样品做出准确判 断。ＷＢ方法将病毒的抗原成分按照分子量进行 分离，可以更好的识别血清样品中的特异结合，因 此被美国Ｃｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒ等机构用作可疑样品的鉴 定方法。 本研究在国内首次对仙台病毒使用ＷＢ方法进 行了抗原蛋白分析，确认了仙台病毒的特异性抗 原。使用ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ和ＷＢ３种方法对无菌大鼠、 ＳＰＦ级大鼠以及清洁级大鼠血清样品进行测定，对 ３种方法的应用进行了比较。 １材料和方法 １．１ ＷＢ的建立方法 仙台病毒抗原蛋白纯化方法参照本中心 ＥＬＩＳＡ试剂盒制备抗原的方法 ，制备常规１２％ 聚丙烯凝胶，使用１２道电泳槽（ＡＥ一６４５０，ＡＴＴＯ）， １１道上样仙台病毒抗原蛋白１０ ｇ，２０ ｍＡ恒流电 泳，至预染分子量标准（ｓｍ０６７１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）达到预 定位置。凝胶分离蛋白经３００ ｍＡ恒流转移１ ｈ至 ＮＣ膜，将此膜固定于多道杂交器（ＡＥ－６１９５， ＡＴＴＯ），使预染分子量标准清晰展示于边侧一道。 含有仙台病毒抗原的１１道，每道加入１：１００稀释 的大鼠血清样品２００ Ｌ，稀释液为含脱脂奶粉３％ 的ＰＢＳＴ。４℃孵育过夜。ＰＢＳＴ ３×１０ ｍｉｎ洗膜后， 和ＨＲＰ标记的兔抗大鼠ＩｇＧ抗体室温杂交１ ｈ。 ＰＢＳＴ ４×１０ ｍｉｎ洗膜后，经ＥＣＬ曝光显影至乳 胶片。 １．２ ＥＬＩＳＡ和ＩＦＡ检测方法 大鼠仙台病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测方法参见本中 心制备的小鼠仙台病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒检 测方法 Ｊ，将酶标记物变更为ＨＲＰ标记的兔抗大鼠 ＩｇＧ抗体。阴性上限判定值为阴性对照ＯＤ４５０读值 ＋０．１５。ＩＦＡ方法采用实验动物国家标准推荐方 法 ］，以感染仙台病毒的ＢＨＫ．２１细胞包被玻片，和 １：４０稀释的待检血清样品反应，之后用荧光标记物 显示特异结合，同时设ＢＨＫ－２１细胞对照，排除非特 异结合的影响。 ２ 结果 ２．１仙台病毒蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ展示可显示血清 样品中抗病毒抗体特异结合 经差速离心分离的仙台病毒经超声处理后和 含ＳＤＳ的上样缓冲液混合处理后进行凝胶电泳，并 转移至ＮＣ膜上。和仙台病毒抗体阴性的大鼠血清 共孵育没有特异性杂交（图１Ａ，Ｎ泳道）；和仙台病 毒抗体阳性的大鼠血清样品共孵育显示出特异条 带（图１Ａ，Ｐ泳道），包括分子量７０×１０ 的条带（箭 头ａ所示）和分子量５７×１０ 的条带（箭头ｂ所示）。 以此方法检测待检血清样品，结果发现无菌大鼠血 清和仙台病毒无特异性杂交（图１Ｂ，１～３泳道），而 来自清洁级的仙台病毒抗体阳性的大鼠血清（经 ＩＦＡ方法证实）可以和ＮＣ膜展示的仙台病毒抗原 特异性结合（图１Ｂ，４—９泳道），包含７０×１０ 和５７ Ｘ １０ 的特异条带。 ２．２ ＷＢ方法的敏感性 使用ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ和ＷＢ３种方法检测２０份无菌 大鼠血清样品，均不能做出阳性判断（表１）。对 ２２７份ＳＰＦ级大鼠血清样品进行检测，ＥＬＩＳＡ方法 检测３份阳性样品，其中２份经ＷＢ检测亦为阳性， 而以ＩＦＡ方法检测没有样品做出阳性判断。对６３ 份清洁级大鼠血清样品进行检测，ＥＬＩＳＡ方法检测 出仙台病毒抗体阳性的样品１０份，而ＷＢ方法检出 仙台病毒抗体阳性样品７份，ＩＦＡ方法检出仙台病 毒抗体阳性样品５份。ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ和ＷＢ在普通环 境大鼠检出仙台病毒抗体的阳性率分别为为 １８．１２％、１１．３４％和１５．８７％。 部分血清样品使用ＩＦＡ方法和ＷＢ检测的结果 如图２所示。来自无菌大鼠的血清样品（ａ）被ＩＦＡ 和ＷＢ方法均作出阴性判定；而仙台病毒接种大鼠 的血清（ｂ）在ＩＦＡ和ＷＢ方法中均显示为阳性；来 自清洁级大鼠血清ｃ和ｄ在ＷＢ方法中作出阳性判 定，而在ＩＦＡ方法中样品ｃ做阳性判定而ｄ样品做 可疑判定；而部分ＳＰＦ大鼠样品（ｅ，ｆ），ＥＬＩＳＡ方法 不能做阴性判定，在ＩＦＡ方法中不能做阳性判定，而 在ＷＢ方法中却被判定为可疑样品。 ３讨论 实验动物国家标准推荐ＥＬＩＳＡ和ＩＦＡ等血清 学检测方法对实验动物病毒性病原体感染情况进 行检测。理想的检测方法应能够对动物感染病毒