姜黄素诱导人慢粒白血病K562细胞凋亡与线粒体途径的关系

维普资讯 http://www.cqvip.com ２４８·　ｔｌ｝界肿瘤孝考２００７年第６卷第４期ＴｕｍｏｕｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｈｅＷｏｒｌｄＶｏｌｕｍｅ　６，Ｎｕｍｂｅｒ４，Ｄｅｃ　２００７　文章编号：１６８３．０３４２（２００７）０４．０２４８．０５　术论著术　姜黄素诱导人慢粒白血病Ｋ５６２细胞凋亡与线粒体途　径的关系　吴丽贤　，许建华　，黄秀旺　，张昆仲　，温彩霞　，陈元仲　摘要：目的研究姜黄素（Ｃｕｒ）对慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）细胞株Ｋ５６２的作用，并且探讨该作用　与线粒体凋亡途径的关系。方法应用Ｍ３￣Ｉ￣法检测Ｃｕｒ对细胞增殖的影响，ＡＯ／ＥＢ荧光染色法、细胞　光度术、ＤＮＡ凝胶电泳等方法观察细胞凋亡，分光光度法检测Ｃａｓｐａｓｅ．３的活性，用蛋白免疫印迹法检　测细胞色素Ｃ的含量。结果Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞抑制作用呈量效、时效关系；Ｃｕｒ对人正常骨髓单个核　细胞与Ｋ５６２细胞之间有一定的选择性，对Ｋ５６２细胞的敏感性约为人正常骨髓单个核细胞的５倍，在　对Ｋ５６２细胞抑制超过９５％时，对人正常骨髓有核细胞几无毒性。Ｃｕｒ　５．０，１０．０ｐｇ／ｍＬ作用２４ｈ，可诱导　Ｋ５６２细胞凋亡，促进细胞色素Ｃ释放，激活ｃａｓｐａｓｅ．３。结论Ｃｕｒ可通过线粒体途径诱导人慢性粒细胞　白血病Ｋ５６２细胞凋亡。　关键词：姜黄素；Ｋ５６２；慢性粒细胞白血病；细胞色素ｃ；ｃａｓｐａｓｅ．３　中图分类号：Ｒ７３３．７；Ｒ７３．３４　文献标识码：Ａ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｃｕｒｃｕｍｉｎ　ｉｎ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｗｕ　Ｌｉ—Ｘｉａｎ，ＸＵＪｉａｎ—Ｈｕａ　，ＨＵＡＮＨＸｉｕ—Ｗａｎｇ，ＺＨＡＮＧＫｕｎ—Ｚｈｏｎｇ，ＷＥＮＣａｉ—Ｘｉａ．ＣＨＥＮＹｕａｎ·Ｚｈｏｎｇ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐｔ．Ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＦＭＵ），Ｆｕｚｈｏｕ　３５０００４，Ｃｈｉｎａ；　Ｆｕｊｉａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ　３５０００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｕｒｃｕｍｉｎ（Ｃｕｒ）ｏｎ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｒｅｖｅａｌ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｃｕｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＭＩＴ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｃｕｒ￣Ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ＡＯ／ＥＢ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ一３　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ｉｎ　ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ａｎｄ　Ｓ－１００　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｕｒ　ｗａｓ　ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｌｏｗ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一３，ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｃｕｒ　ｗａｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ；ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ；ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ；ｃａｓｐａｓｅ·３　姜黄素（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ，Ｃｕｒ）系从姜科植物姜黄中　胞均有明显的体外杀伤作用，并且对Ｂ１６、ＥＡＣ等　提取的酚性色素，有抗氧化、抗突变、抗促癌、抗炎、　小鼠瘤株均有显著的体内抗癌作用。有关Ｃｕｒ对人　抗血小板、降血脂等广泛的药理作用…，我们的前　慢性粒细胞白血病Ｋ５６２细胞的杀伤动力学特征以　期研究发现　Ｊ，Ｃｕｒ对ＭＧＣ８０３、Ｂｅ１７４０２、Ｂ１６细　及对人正常骨髓细胞的细胞毒作用均未见文献报　收稿日期：２００７．０７．１９：修回日期：２００７．０８．３１　道。本文对此加以研究，并进一步研究Ｃｕｒ对人白　基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ　３０１７１１５８，３０４７２１８７）资助：福建　省资助省属高校项目（Ｎｏ　２００５Ｋ０４８）资助　血病Ｋ５６２细胞凋亡的影响，探讨其作用机理为Ｃｕｒ　作者单位：福建医科大学１药理系；２临床药理研究所，福建福州　用于治疗人慢性粒细胞白血病奠定基础。　３５０００４：３福建省血液研究所，福建福州３５０００４　作者简介：吴丽贤（１９７５．），女（汉族），博士学位，教师．主要研究　１材料和方法　方向：抗癌药理。　通讯作者：许建华（１９５８．），男（汉族），福建省福州市人；博士学位，　１．１材料　博士生导师：福建医科大学药学院院长；先后主持国家自然科学基金　项目、教育部重点科研项目、全国高校骨干教师课题、省部级重大科研　１．１．１　实验药品和试剂Ｃｕｒ按文献　。　方法从福建　课题；发表论文４０余篇，获科研成果奖多项．主要研究方向：药理学。　建阳地区产的姜黄（Ｃｕｒｃｕｍａ　Ｌｏｎｇａ　Ｌ）中提取、分　维普资讯 http://www.cqvip.com ｔｌ｝界肿霜孝专２００７年第６卷第４期ＴｕｍｏｕｒＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＷｏｒｌｄＶｏｌｕｍｅ　６．Ｎｕｍｂｅｒ４，Ｄｅｃ　２００７　·２４９·　离，经硅胶薄层及ＨＰＬＣ鉴定，与标准品的比移值　相同。吖啶橙（ＡＯ）及溴乙锭（ＥＢ）为Ｆｌｕｋａ公　司产品。流式细胞仪ＤＮＡ含量测定试剂盒（Ｋｉｎｅｓｉｓ　５０）为ＢＩＯ—ＲＡＤ产品，ｃａｓｐａｓｅ一３活性测定试剂盒　均为南京凯基生物公司产品。　１．１．２细胞株及培养条件人慢性粒细胞白血病　Ｋ５６２细胞引自中国科学院细胞库，培养于含１０％　新生牛血清、ＩＯＯＩＵ／ｍＬ青霉素、ｌＯＯｇｇ／ｍＬ链霉素　的ＰＲＭＩ１６４０培养液传代、培养。取指数生长期的　细胞用于实验。指数生长期和坪期细胞的制备参照　文献ｐ　进行。　１．２方法　１．２．１　人正常骨髓有核细胞的分离与培养　选择　缺铁性贫血病人或其它非肿瘤病人的骨髓，常规骨　髓穿刺，采集骨髓，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液　梯度离心分离有核细胞，ＰＢＳ洗３次，以含１５％胎　牛血清，ＩＯＯＩＵ／ｍＬ青霉素、ｌＯＯｇｇ／ｍＬ链霉素的　ＲＰＭＩ　１６４０培养液制成细胞悬液，常规原代培养，　以ＭＴＴ法测定Ｃｕｒ对骨髓细胞的影响。　１．２．２　Ｃｕｒ对细胞增殖抑制的观察　１．２．２．１　ＭＴＴ法观察Ｃｕｒ的细胞毒作用　参照文献　【　进行。　１．２．２．２　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞集落形成率的影响【７】实　验组及对照组各４孔，前者加入一定浓度的药物，　后者加入等量溶剂，作用２ｈ后，洗去含药的培养液，　接种于２４孔培养板中，２００个细胞／孔，加培养液　ｌｍＬ，于３７￣Ｃ，５％ＣＯ２培养７～ｌＯｄ，计数集落数，　多于５０个细胞者计为集落。存活率＝给药组集落数　，对照组集落数ｘｌＯ０％。　１Ｉ２＿２．３量效关系曲线分析【８】　以药物浓度对细胞　存活率的对数值做线性回归，计算Ｄｏ值【Ｄｏ为使细　胞存活率下降６３％的药物浓度，Ｄｏ＝一１／（２．３０３ｘｂ），　ｂ为量效关系曲线之斜率】。　１．２．３　Ｃｕｒ对细胞凋亡的观察　１．２．３．１　ＤＮＡ倍体分析取药物作用后的细胞悬　液，以ＰＢＳ调整浓度为１０ｂ，ｍＬ，取２００ｇＬ加入　Ｋｉｎｅｓｉｓ５０试剂，室温避光孵育３０ｍｉｎ，用ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ　ＦＡＳｃａｎ型流式细胞仪作ＤＮＡ分析，　以ＭｏｄＦｉｔ　ＬＴ软件分析细胞ＤＮＡ含量分布直方图，　拟合并计算各时相的细胞及亚二倍体凋亡细胞的百　分比。　１．２＿３．２　ＤＮＡ凝胶电泳参照文献　进行。　１．２．４胞浆部分（Ｓ．１００）和线粒体部分裂解液提取　［１Ｏｌ取加药处理或未处理细胞ｌｘｌＯ　悬浮于５倍体　积的缓冲液Ａ（０．０２　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ—ＫＯＨ　ｐＨ　７．５，０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣＬ，０．００　１　５ＭｇＣ１２　ｍｏｌ／Ｌ，０．Ｏ０　１　ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡＮａ２，０．Ｏ０　１　ｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ，０．Ｏ０　１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，０．２５　ｍｏｌ／Ｌ蔗糖），用２２号针头吹吸使其均一化，８００ｘｇ　离心１０　ｍｉｎ，取上清４℃１２０００ｘｇ离心ｌＯｍｉｎ，沉淀　即为线粒体，将上清于ｌＯ００００ｘｇ离　￣６０ｍｉｎ，此时　上清即是胞浆部分（Ｓ一１００）。线粒体溶解于缓冲液　Ｂ（０．０５　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１　ｐＨ　７．５，０．１５　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，　０．００２　ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡＮａ２，０．００１　ｍｏｌ／Ｌ钒酸钠，体积分　数为１％的Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００，０．００１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ）。胞浆　部分（Ｓ一１００）和线粒体部分裂解液用于免疫印迹，　测定细胞色素Ｃ含量。　１．２．５　免疫印迹法检测蛋白含量变化【ｌｌＪ提取药　物处理后的细胞蛋白，用Ｌｏｗｒｙ法进行定量，紫外　分光光度仪检测，调节每份样品蛋白浓度，加等量　蛋白于２ｘＳＤＳ样品缓冲液『０．１ｍｏｌ／Ｌ＂Ｉｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ　６．８，２０％甘油，４％ＳＤＳ，０．Ｏ０５ｇ溴酚蓝，１０％１３一　巯基乙醇１，煮沸５ｍｉｎ，在ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶中　进行电泳；或用免疫共沉淀法所得样品电泳。电泳　后转膜，ＮＣ膜以丽春红染色观察转膜效果，并标　出各标准分子量的位置，拍照后，用蒸馏水漂洗脱　色，再将ＮＣ膜置于塑料袋中，加入封闭液封闭１ｈ　后，加细胞色素Ｃ和１３－ａｃｔｉｎ单抗室温作用１ｈ，洗　去未结合的一抗，以Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ试剂盒ＪＪｎ－－抗，　再予染色，拍照。　１．２．６分光光度法检测Ｃａｓｐａｓｅ一３的活－性Ｃａｓｐａｓｅ一　３分光光度法检测试剂盒是将ｃａｓｐａｓｅ一３序列特异性　的多肽偶联至发色基团。当该底物被ｃａｓｐａｓｅ一３剪切　后，发色基团即游离出来，可通过酶标仪或分光光　度计（Ｌ＝４０５ｎｍ或４００ｎｍ）测定其吸光值，可考察　ｃａｓｐａｓｅ一３的活化程度。按试剂盒说明书操作。　２结果　２．１　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞与人正常骨髓有核细胞的细　胞毒特点　２．１．１　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞抑制的量效、时效关系　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞抑制作用的量效、时效关系见图　１，其ＩＣ５０为４．３０ｐ．ｇ／ｍＬ。Ｃｕｒ　ｌＯｐ．ｇ／ｍＬ对Ｋ５６２细　胞作用４８ｈ，以ＭＴＴ法测定细胞增殖状态，其增殖　抑制率达９５％以上。　２．１．２　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞集落形成抑制的量效关系　Ｃｕｒ对不同增殖状态Ｋ５６２细胞集落形成抑制的量　效关系曲线见图２，Ｃｕｒ不论对增殖期细胞还是坪　期细胞，其量效关系曲线均呈典型的坪指数型，提　示Ｃｕｒ不论对增殖期细胞还是坪期细胞的抑制均存　在阈浓度。对增殖期与坪期细胞的Ｄ０值分别为　维普资讯 http://www.cqvip.com

‘２５０。　世界肿瘤袭砉２００７年第６卷第４期Ｔｕｍｏｕｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｖｏｌｕｍｅ　６，Ｎｕｍｂｅｒ４，Ｄｅｃ　２００７　４．３３￣ｇ／ｍＬ、８．６０￣ｔｇ／ｍＬ，阈浓度分别为２．５￣ｇ／ｍＬ、　５．Ｏ　ｇ／ｎ　，提示Ｃｕｒ对增殖期细胞的敏感性约为坪　期细胞的２倍。　∽　＿ｖ一《ａｌ　细胞之间有一定的选择性，Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞的ＩＣ５０　Ｏ　Ｏ　１　１　为４．３ｇｇ／ｍＬ，而对人正常骨髓单个核细胞的ＩＣ５０　∞　∞约为２０￣ｇ／ｍＬ，对Ｋ５６２细胞的敏感性约为人正常　骨髓单个核细胞的５倍。在Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞抑制　超过９５％时，对人正常骨髓单个核细胞几无毒性。　Ｂ　２．１．３　Ｃｕｒ对人正常骨髓有核细胞的细胞毒特点　从图３可见，Ｃｕｒ对人正常骨髓单个核细胞与Ｋ５６２　Ａ　０　２　４　６　８　１　０　０　１　２　２４　３６　４８　Ｃｕｒ（ｔｔ　ｍＬ１　Ｔｉｍｅ　ｆｈ１　图１　Ａ　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞的体外杀伤效应　图１　Ｂ　Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞的抑制作用　Ｆｉｇ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＣｕｒｏｎＫ５６２　ｃｅｌｌｓ　２．２　Ｃｕｒ诱导Ｋ５６２细胞凋亡的作用　２．２．１流式细胞光度术分析细胞凋亡Ｃｕｒ　２．５，５，　１０￣ｇ／ｍＬ作用后２４ｈ，以流式细胞仪分析细胞ＤＮＡ　含量直方图，于５，１０￣ｇ／ｍＬ浓度，可见典型的亚　２倍体峰（图４　Ａ３，Ａ４）提示Ｃｕｒ　５，１０￣ｇ／ｍＬ作　用后２４ｈ可诱导Ｋ５６２细胞凋亡，且呈量效关系。　２．２．２　片段化ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳分析　Ｃｕｒ　０　５　１０　１５　２０　２．５，５．０，１０．０￣ｇ／ｍＬ对Ｋ５６２细胞分别作用２４ｈ，　ＣＨＩ＂ｕ￣ｌｍＬ　提取细胞ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图４Ｂ，　Ｃｕｒ　５．０，１０．Ｏｕｇ／ｎ　可引起Ｋ５６２细胞ＤＮＡ的降解，　见明显的凋亡特征性梯状条带。　２．３　Ｃｕｒ对白血病细胞触发作用　Ｃｕｒ触发白血病　细胞线粒体细胞色素Ｃ释放Ｃｕｒ５、ｌＯ￣ｇ／ｍＬ均能促进　Ｋ５６２细胞中细胞色素Ｃ从线粒体释放，胞浆Ｓ一１００　中的含量逐渐增加，相反，线粒体中的细胞色素Ｃ　含量逐渐减少（图５Ａ），提示Ｃｕｒ可通过触发细胞色　素Ｃ从线粒体释放入胞浆，激活下游的凋亡通路。　２．４　Ｃｕｒ的活化作用Ｃｕｒ活化Ｃａｓｐａｓｅ一３　Ｃｕｒ５、　图２　Ｃｕｒ对不同增殖状态Ｋ５６２细胞集落形成抑制的量效关系曲线　Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｃｕｒ　ｏｎ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｐｌａｔｅａｕ　ｃｅｌｌｓ　０　５　１０　１５　２０　１０￣ｇ／ｍＬ均能促进Ｋ５６２细胞中ＯＤ值升高（图５Ｂ），　提示偶联有发色基团的Ｃａｓｐａｓｅ一３序列特异性的多　肽底物被Ｃａｓｐａｓｅ一３剪切，发色基团游离出来，说　明Ｃａｓｐａｓｅ一３被细胞色素Ｃ激活。　Ｃｕｒ　ｒｔｇ／ｍＬ　图３　Ｃｕｒ对人正常骨髓单个核细胞与Ｋ５６２细胞毒的比较　Ｆｉｇ　３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｃｕｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄＫ５６２　ｃｅｌｌｓ　维普资讯 http://www.cqvip.com

世界肿瘪孝专２００７年第６卷第４期Ｔｕｍｏｕｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｖｏｌｕｍｅ　６，Ｎｕｍｂｅｒ４，Ｄｅｃ　２００７　·２５１·　Ａｌ　Ａ２　Ａ３　Ａ４　Ｂ　Ｂ１　Ｂ２　Ｂ３　Ｂ４　Ｂ５　图４　Ｃｕｒ诱导Ｋ５６２细胞凋亡的ＤＮＡ倍体分析　Ｆｉｇ４　ＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔｔｅｓｔｅｄｂｙｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｌ，Ｂｌ：ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａ２，Ｂ２：Ｃｕｒ　２．５　ｐ＿ｇ／ｍＬｆｏｒ　２４　ｈ：Ａ３，Ｂ３：Ｃｕｒ　５ｐ＿ｇ／ｍＬｆｏｒ　２４　ｈ　Ａ４，Ｂ４：Ｃｕｒ　１０￣ｇ／ｍＬｆｏｒ　２４　ｈｌ　Ｂ５：ＤＮＡｍａｒｋｅ￣　Ａ　Ｂ　■　触　ｉ　Ｃｏｎｔ　Ｃｕｒ５　Ｃｕｒｌ０（ｕｇ／ｍ１）　图５　Ｃｕｒ触发Ｋ５６２细胞线粒体细胞色素Ｃ释放，活化ｃａｓｐａｓｅ　３　Ｆｉｇ５　Ｃｕｒ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ｆｒｏｍ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　ｉｎ　Ｋ５６２　ｃｅｌｌｓ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ　３　３讨论　作用２ｈ的杀伤效果与以ＭＴＴ法测定同浓度Ｃｕｒ对　细胞作用４８ｈ的杀伤效果相近。这种时效差异系由　于ＭＴＴ法以测定残留活细胞作为判断药物杀伤的　基础，在药物作用终止时，活细胞群体中还包括已　姜黄素系从姜科植物姜黄中提取的Ｂ二酮多酚　类有效单体化合物，具有抗氧化、抗突变、抗促癌、　抗炎等广泛的药理作用，且价格低廉，毒性很低【Ｊ　Ｊ，　该药的抗癌作用已有较多报道，但对慢性粒细胞白　血病（ＣＭＬ）的诱导凋亡作用未见报道。本文发现，　Ｃｕｒ对Ｋ５６２有较强的杀作用，且呈量效、时效关系，　ＩＣ５０分别为４．３￣ｇ／ｍＬ。Ｃｕｒ对人正常骨髓单个核细　胞与Ｋ５６２细胞之间有一定的选择性，对Ｋ５６２细胞　接受药物致死性损伤，失去增殖能力但暂时还未丧　失活力的细胞，因此低估了药物的作用，同时还无　法克服在药物作用过程中活细胞增殖对药物杀伤动　力学的干扰。本文以集落形成法分析Ｃｕｒ对不同增　殖状态Ｋ５６２细胞的杀伤动力学，通过量效曲线分　析发现，Ｃｕｒ不论对增殖期细胞还是坪期细胞，其　量效关系曲线均呈典型的坪指数杀伤型，提示Ｃｕｒ　对Ｋ５６２细胞的杀伤均存在阈浓度。对增殖期与坪　期细胞的Ｄ０值分别为４．３３、８．６０１ｘｇ／ｍＬ，阈浓度分　别为２．５、５．０¨　ｎＬ，提示Ｃｕｒ对增殖期细胞的敏感　的敏感性约为人正常骨髓有核细胞的５倍，在对　Ｋ５６２细胞抑制超过９５％时，对人正常骨髓单个核　细胞几无毒性，Ｃｕｒ对Ｋ５６２细胞细胞的选择性杀伤　作用提示该药具有很好的应用前景。　集落形成法为判断细胞增殖状态的可靠方法　【８Ｊ本文以此方法测定Ｃｕｒ　１～１０￣ｇ／ｍＬ对Ｋ５６２细胞　性约为坪期细胞的２倍，属于优势杀灭增殖期细胞　维普资讯 http://www.cqvip.com ·２５２·　世界肿瘤孝专２００７年第６卷第４期Ｔｕｍｏｕｒ　ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＷｏｒｌｄＶｏｌｕｍｅ　６，Ｎｕｍｂｅｒ４，Ｄｅｃ　２００７　的抗癌药。　ｒｈｉｚｏｍｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｃｕｍａ　ｘａｎｔｈｏｒｒｉｚａ　ａｎｄ　ａｌｐｉｎｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ［Ｊ１．　Ｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｕｌｌ，１９８７，３５：３２．３８．　Ｋ５６２细胞是来源于慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）　红白血病变的细胞株，对化疗药物诱导的细胞调亡　有很强的抵抗性，这种抗凋亡的机理可能与ＣＭＬ　特征性的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因所表达的Ｐ２１０ｂｃｒ／ａ　融合　蛋白具有很强的酪氨酸激酶（ＰＴＫ）活性有关［１¨。本　文以ＡＯ／ＥＢ荧光染色法、ＤＮＡ倍体分析、ＤＮＡ凝　［５】　［４】　许建华，李常春，黄自强．雷公藤内脂对ＨｅＬａ细胞的细胞动力　学影响［Ｊ】．中国药理学报，１９８９，１０（６）：５５０—５５６．　周建军，乐秀芳，韩家娴，等．评价抗癌物质活性的改良ＭＴＴ　方法［Ｊ】．中国医药工业杂志，１９９３，２４（１０）：４５５—４５８．　［６】　Ｂａｒｒａｎｃｏ　ＳＣ，Ｎｏｖａｋ　ＪＫ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ　ＲＭ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　１，　３－ｂｉｓ　胶电泳以及电镜超微结构观察等方法分析表明，Ｃｕｒ　５．０，１０．０￣ｔｇ／ｍＬ作用２４ｈ，可诱导Ｋ５６２细胞凋亡，提　示Ｃｕｒ对ＣＭＬ的治疗可能具有一定的意义。细胞　凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活　细胞内的凋亡酶ｃａｓｐａｓｅ，另一条是通过线粒体释放　凋亡酶激活因子激活ｃａｓｐａｓｅ。这些活化的ｃａｓｐａｓｅ　可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。本研　究表明，Ｃｕｒ能促进Ｋ５６２细胞中细胞色素Ｃ从线　粒体释放，激活Ｃａｓｐａｓｅ．３，引起细胞凋亡。　参考文献：　［１】　Ａｍｍｏｎ　ＨＰＴ，Ｗａｈｌ　ＭＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃｕｒｃｕｍａ　ｌｏｎｇａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ，１９９１，５７（１）：１－７．　［２】　［９】　［８】　［７】　（２－ｃｈｌｏｒｏ—ｅｔｈｙ１）·１－ｎｉｒｔｏｓｏｕｒｅａ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｌａｔｅａｕ　ｐｈａｓｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　１９７３，３３（１）：６９１—６９６．　李学汤，林晨，李佩茵．体外测定抗癌药物细胞毒作用的方法比　较［Ｊ】．中华血液学杂志，１９８６，８（３）：１８４—１８８．　陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等．ＡＯ／ＥＢ荧光染色法测定阿糖胞苷　诱导ＨＬ一６０细胞凋亡［Ｊ】．中华血液学杂志，１９９８，１９（１）：４１—４８．　Ｂｅｄｉ　Ａ，Ｂｕｒｂｅｒ　ＪＰ，Ｂｅｄｉ　ＧＣ，ｅｔ　ａ１．ＢＣＲ—ＡＢＬ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｌａｙ　ｏｆ　Ｇ２／Ｍ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ：ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｔｏ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　ａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，　１９９５，８６（２）：１　１４８—１　１５２．　ｎ　Ｊ，Ｘｕ　Ｇ，Ｙｅｕｎｇ　ＳＣ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｓ　ｕｐｓｒｅａｍ　ｔｔｏ　［１０】　Ｐａａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ一９，ｃａｓｐａｓｅ·８，ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ一３　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｍａｎｕｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，２００１，８６（３）：４７３１—４７４０．　许建华，赵蓉，吴国土，等．姜黄素的体内外抗肿瘤作用［Ｊ】．中　药药理与临床，１９９８，１４（３）：１５—１７．　［１ｌ】　吴丽贤，许建华，黄秀旺，等．姜黄素对Ｋ５６２细胞增殖的影响　及其与Ｐ２１０　激活的Ｒａｓ信号途径的关系［Ｊ】．中国药理学通　［３】　Ｕｅｈａｒａ　ＳＩ，Ｙａｓｕｄａ　Ｉ，Ａｋｉｙａｍａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉａｒｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　报，２００３，１９（１）：３３—３７．　（上接第２４７页）　ｒｉｎｅ　ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｂｙ　ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｒｕｇｓ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１　１０（６）：８２５·８３０．　ｈ　ＪＹ，Ｙｅｎ　ＭＬ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ·２　ｉｎｄｕｃｅｓ　［１０】　Ｓｕｎ　ＪＬ，Ｓｈｉｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ一２　ｉｎ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｈｅ　ｅｓｏｐｈａｇｕｓ［ｔＪ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ，２００５，１８９：１　１０·１　１５．　ｓｋｅ　Ｋ，Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ　ＡＴ，Ａａｍｄａｌ　Ｓ，ｅｔ　１．Ｄｅｔａｃｔｅｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　［１４】　Ｂｅｉｍｅｔａｓｔａｓｅｓ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＥＰＩ·ｎｄ　ａＨＥＲ·２／Ｎｅｕ·ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ·　Ｃ　ｕｐ·ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｌｕｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，２００２，１４１：　５３１．５３８．　ｅｎｎａｎ　ＪＡ，Ｈｒｕｂａｎ　ＲＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒ　ａｓｓｅｓｓａｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　［１５】　Ｂｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ】．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，６４（２）：５５４·５６４．　Ｋｉｍ　ＨＳ，Ｙｏｕｍ　ＨＲ，Ｌｅｅ　ＪＳ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｙｃｌｏｏｘｙ　２　ｇｅｎａｓｅ　２　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｎｏｎ２ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．　Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ，２００３，４２：１６３·１７０．　　ａ１．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　［１２】　Ｈｅｅｈａｎ　ＫＭ，Ｓｈｅａｈａｎ　ＫＯ，Ｄｏｎｏｇｈｕｅ　ＤＰ，ｅｔｓｔａｇｉｎｇ　ｉｎ　ｓｑｕａｍｏｕｓ·ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｈｅ　ｈｅａｄ　ｔｎｄ　ａｎｅｃｋ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇ　Ｊ　Ｍｅｄ．２００３．７：４２９．４３５．　ｐｐｅｌｉｕｓ　Ａ，Ｋｕｆｅｒ　Ｐ，Ｈｏｎｏｌｄ　Ｇ　ｅｔ　ａ１．Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　［１６】　Ｚｉｒｅｖｅｒｓｅ·ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓａｔｔｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｌ　ｃａａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｅｔｂｗｅｅｎ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ·２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｎｄ　ａｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ，２００５，３７８（１３）：１２５４·１２５７．　Ｔ，Ｅｚａｋｉ　Ｔ，Ｋａｂａｓｈｉｍａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｇｎｉｉｃａｆｎｃｅ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ·　［１３】　Ｎｏｚｏｅ　ｍａｒｒｏｗ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ，１９９７，１５：２７０１·２７０８．