三七总皂苷对严重烫伤大鼠心肌的保护作用研究

药物研究　２００７年第１６卷第２１期　三七总皂苷对严重烫伤大鼠心肌的保护作用研究　黄（１．中国人民解放军第３２４医院，重庆恩　，金宏伟・，郑永　４０００１０）　４０００２０；　２．重庆医科大学第二附属医院，重庆摘要：目的研究三七总皂苷对严重烫伤大鼠心脏收缩舒张功能及心肌细胞凋亡发生的影响。方法通过大鼠４０％体表皮肤Ⅲ度烫伤模型　（时相点为伤后６，１２，２４　ｈ），应用生理记录仪监测、心肌组织切片脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）、染色等技术观　察大鼠严重体表烫伤后心脏收缩舒张功能变化及心肌细胞凋亡情况，观察三七总皂苷对它们的影响，同时检测三七总皂苷对烫伤大鼠心　肌组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性、丙二醛（ＭＤＡ）含量变化的影响。结果大鼠严重烫伤后心脏收缩舒张功能显著下降，心肌组织ＴＵＮＥＬ　阳性细胞数增加，心肌组织发生了脂质过氧化反应，烧伤后１２　ｈ最显著。应用三七总皂苷后心脏功能下降趋势缓解、ＴＵＮＥＬ阳性细胞率下　降、心肌脂质过氧化反应减轻。结论烧伤后心肌组织发生了以心功能下降、心肌细胞凋亡为特征的心肌损害，三七总皂苷能减轻大鼠烧伤　后的心肌功能损害，其机制与减轻脂质过氧化反应及降低心肌细胞凋亡发生率有关。　关键词：烧伤；心肌；凋亡；三七总皂苷；脂质过氧化　中图分类号：１１２８５．５：Ｒ２８６．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—４９３１（２００７）２１—００１０—０２　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐａｎａｘ　Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　Ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｒｅｌｙ　Ｓｃａｌｄｉｎｇ　Ｒａｔ　Ｈｕａｎｇ　Ｅｎ｜，Ｊｉｎ　Ｈｏｎｇｗｅｉ｜，Ｚｈｅｎｇ　Ｙｏｎ　ｆ　Ｊ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｏ．３２４　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ、Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ　４０００２０；　２、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ　４０００１０）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｓｙｓｔｏｌｉｃ，ｄｉａｓｔｏｌｉｃ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｕｓｃｌｅ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒｅｌｙ　ｓｃａｌｄｅｄ　ｒａｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　４０％ｓｋｉｎ—ｆｕｌｌ—ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ｓｃａｌｄ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ，ｔｈｅ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　６，１　２，２４　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｓｃａｌｄ　Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｗａｓ　ｗａｔｃｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｃｏｒｄｅｒ、Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ＴｄＴ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｉｏｔｉｎ　ｄＵＴＰ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）、Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｍＭｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｌｓｏ、Ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅａｎｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｒｔ　ｏｆ　ｓｃａｌｄ　ｒａｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｏｏ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｓｃａｌｄ，ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＴＵＮＥＬ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ．Ａｌｌ　ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ａｔ　１　２　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｓｃａｌｄ、Ａｆｔｅｒ　ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ，ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｅｎｄｅｎｃｙ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｌｏｗｅｄ，ｔｈｅ　ＴＵＮＥＬ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｒａｔｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｗａｓ　ｌｉｇｈｔｅｎｅｄ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｒａｔ　ｗａｓ　ｓｃａｌｄｅｄ、Ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｃａｎ　ｌｉｇｈｔｅｎ　ｔｈｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｏｆ　ｓｃａｌｄｅｄ　ｒａｔ，ｔｈｅ　ｍｅｃｈｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｍａｙ　ｂｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｒａｔｒ　ｈｅａｒｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｕｒｎ；ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ；ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　试验研究和临床观察均证实机体体表严重烫伤后常有显著的　４５０￣ｇ／ｋｇ组（ｃｔ，ｃ　，ｃ，组）。试验前动物以戊巴比妥钠（３０　ｍｇ／ｋｇ）　腹腔麻醉，背部以９２℃烫伤１８　ｓ，造成４０％Ⅲ度烫伤模型，伤后按　Ｐａｒｋｌａｎｄ公式（编者注：补充电解质的计算公式）补液　，同时按体　重给药。观察时相点为伤后６，１２，２４　ｈ，每组每时相点动物观察数　为５只。于不同时相点处死大鼠，取材（心脏左室壁）。将标本分为　心功能障碍，如心脏收缩舒张功能降低、心输出量下降等…。在此　过程中，心肌以何种损害为特征已有较深入的研究，但心肌细胞凋　亡在大鼠严重烫伤后的发生规律未见研究报道，目前为止，针对严　重烫伤后的心脏衰竭也无有效的药物治疗。三七总皂苷（ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ，ＰＮＳ）是五加科人参属多年生植物三七的主要　活性成分，具有广泛的药理作用，能改善心脏功能　】，但严重烫伤　两部分，一部分放入液氮用于制备组织匀浆，另一部分放入４％多　聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用于细胞凋亡检测。　１．３　大鼠左心功能检测　后外源性ＰＮＳ起何作用尚需深入研究。本课题即通过大鼠４０％的　体表烫伤模型观察烫伤后大鼠的心脏功能改变、心肌细胞凋亡发　生规律及ＰＮＳ对此的影响及意义。　１　材料与方法　大鼠麻醉后，在无菌条件下分离出一侧颈总动脉，结扎远心　端，用眼科剪于动脉近心端剪一小口，迅速插入预先注满肝素等渗　盐水（１　０００　Ｕ／ｍＬ）的硅胶管，将另一端以换能器与八道生理记录仪　相连，小心推进硅胶管直至左心室波形出现。固定硅胶管，记录波　形，分析各时相点左心室最大收缩压（１ｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｓｙｓｔｏｌｉｃ　ｐｒｅｓ—　１．１　主要仪器与材料　ＰＮＳ粉剂（中国科学院昆明植物研究所提供，纯度＞９９％）。原　位细胞凋亡检测试剂盒（美国罗氏公司）；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）检　测试剂盒、丙二醛（ＭＤＡ）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。　ｓｕｒｅ，ＬＶＳＰ）、左心室舒张末压（１ｅｔｆ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｅｎｄ—ｄｉａｓｔｏｌｉｃ　ｐｒｅｓ—　ｓｕｒｅ，ＬＶＥＤＰ）。　Ｌｅｉｅａ　２１５５型切片机（德国）；ＲＭ　６２００型八道生理记录仪（日本）：　ＤＵ一７型紫外分光光度计（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ５０型　光学显微镜及照相系统（１３本）。　１．２　动物分组及致伤方法　１．４　ＤＮＡ切口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测细胞凋亡　按操作说明书进行。将５　ｍ切片常规脱蜡水化，３％过氧化氢　封闭１０　ｍｉｎ，蛋白酶Ｋ（２０￣ｇ／ｍＬ）３７％恒温水箱孵育２０　ｍｉｎ，正常　山羊血清封闭２０　ｍｉｎ，样品加５０　ＬＴＵＮＥＬ反应液，３７％湿盒孵育　６０　ｍｉｎ，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）清洗３次。样品加５０　Ｌ辣根过氧化酶　（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ　ＰＯＤ），３７℃湿盒孵育３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，二氨基联苯　健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠６５只，由第三军医大学试验动物中心提供，　体重２００—２５０　ｇ。随机分为正常对照组（Ａ组）、烫伤组（Ｂ组）、ＰＮＳ　给药组（ｃ组），其中ｃ组又按给药剂量分为３组，分别为５０，１５０．　・１０・　胺（ＤＡＢ）显色。苏木素复染，封片，显微镜下观察照相。于各时相点　中国药业Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年第１６卷第２１期　药物研究　袁１　大鼠严重烫伤后ＬＶＳＰ及ＬＶＥＤＰ改变（ｋＰａ／ｓ，　±ｓ，ｎ：５）　将每张切片在４００倍显微镜下观察，随机取５个视野，计阳性细胞　数和总细胞数，两者比值即为细胞凋亡百分率。　１．５　ＳＯＤ活性与ＭＤＡ含量检测　以黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定ＳＯＤ活性，化学比色法测定　ＭＤＡ含量，均按说明书操作，采用ＤＵ一７型紫外分光光度计检测。　１．６统计学分析　数据以　±　表示，采用ＳＰＳＳ　１０，０统计程序进行分析。　２　结果　注：与Ｂ组比较，　Ｐ＜０．０５，　Ｐ＜０，Ｏ１（下表同）。　不同时相点左心功能变化：正常对照组（Ａ组）ＬＶＳＰ为（２１．１±　显著增多，２４　ｈ时阳性细胞数有所减少；Ｃ组阳性细胞率较Ｂ组减　１．６）ｋＰａ／ｓ；大鼠严重烫伤后６　ｈ　ＬＶＳＰ即下降，１２　ｈ达到最低，２４　ｈ　少，尤以Ｃ　组（４５０　Ｉｘｇ／ｋｇ剂量）作用显著。结果见表２。　有所恢复；Ｃ组ＬＶＳＰ下降程度均较轻，其中以Ｃ，组（４５０　ｐ，ｇ／ｋｇ　左室心肌ＳＯＤ活性及ＭＤＡ含量检测结果：Ａ组心肌组织匀浆　剂量）最为显著，其１２　ｈ　ＬＶＳＰ值显著高于Ａ组。Ａ组ＬＶＥＤＰ为　（１：１０）ＳＯＤ活性为（３１４．３±２９．５）Ｕ／ｍＬ；Ｂ组伤后６　ｈ　ＳＯＤ活性　（１．１±０．１）ｋＰａ／ｓ；大鼠严重烫伤后６　ｈ　ＬＶＥＤＰ显著升高，其他两　显著下降，１２　ｈ降为最低；Ｃ组ＳＯＤ活性下降程度较轻．其中Ｃ组　个时相点有所降低；给药组ＬＶＥＤＰ值上升程度均较轻，其中仍以　（５０￣ｇ／ｋｇ剂量）即有显著变化，Ｃ　，Ｃ，组（１５０，４５０　Ｉｘｇ／ｋｇ剂量）作　Ｃ　组改变最为显著。结果见表１。　用更显著。Ａ组心肌匀浆（１：１０）ＭＤＡ含量为（３１．８±２．９）ｎｍｏｌ／ｍＬ；　左室心肌细胞凋亡原位检测：Ａ组未见ＴＵＮＥＬ阳性心肌细　Ｂ组伤后６　ｈ心肌ＭＤＡ含量显著升高，１２　ｈ为最高；Ｃ组ＭＤＡ含量　胞；Ｂ组伤后６　ｈ可见部分心肌细胞发生凋亡，伤后１２　ｈ阳性细胞　升高程度较低，以Ｃ　组（４５０￣ｇ／ｋｇ剂量）作用最显著。结果见表２。　袁２　大鼠严重烫伤后左室心肌细胞凋亡率（　±ｓ，ｎ＝５）　３　讨论　心脏产生效应尚待进一步研究。　心肌细胞是一种终末细胞，在遭受伤害致死后不能再生．因此　总之，ＰＮＳ具有改善烧伤后心脏功能的作用，呈正相关剂量效　其存活对心脏功能具有重要意义。机体严重烧伤后出现的多器官　应，其机制与降低脂质过氧化反应程度和减少心肌细胞凋亡发生　功能衰竭往往以心泵输出量减少为直接诱因，心脏功能衰竭的发　有关。烧伤后ＰＮＳ对心脏的作用机制可能是多种效应的综合结果，　生机制如何～直是困扰研究者的难题之一。本研究结果显示，细胞　深入阐明其作用机制是今后的研究目标之一。　凋亡的发生参与了严重烧伤后心肌细胞损害，细胞凋亡率在伤后６　ｈ　作者简介：黄恩（１９６４一），男，硕士，副主任医师，主要从事药　即达５．９％，伤后ｌ２　ｈ则高达９．９％，因此可以认为，凋亡参与了大　学研究工作，（电子信箱）３２４ｙｊｋ＠１６３．ｃｏｒｎ。　鼠体表严重烧伤后心肌损害的过程，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ等的研究也支持本结　参考文献：　论　】。对心肌的ＳＯＤ活性及ＭＤＡ含量测定结果表明，在细胞凋亡　［１］Ｍａａｓｓ　ＤＬ，Ｗｈｉｔｅ　Ｊ，Ｈｏｒｔｏｎ　ＪＷ．ＩＬ一１　ｂｅｔａ　ａｎｄ　ＩＬ一６　ａｃｔ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ　的发生过程中，心肌组织在烧伤后发生了较高水平的脂质过氧化　ｗｉｔｈ　ＴＮＦ—ａｌｐｈａ　ｔｏ　ａｌｔｅｒ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｂｕｍ　ｔｒａｕｍａ　反应。烧伤后发生的脂质过氧化反应与氧自由基的大量产生有关，　［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ，２００２，１８（４）：３６０—３６６．　而氧自由基不但直接造成心肌细胞的脂质过氧化损害．而且也是　［２］陈　锋，王成天，王焱林，等．三七总皂甙预处理对在体大鼠心肌缺血　心肌细胞发生凋亡的重要诱因＿５】。　再灌注的保护作用［Ｊ］．中华麻醉学杂志，２００２，２０（７）：４３７—４３８．　ＰＮＳ中的主要作用物质是三七皂苷单体，具有扩张血管、抵抗　［３］张家平，黄跃生，周　新，等．严重烫伤大鼠心肌细胞凋亡与心功能损　心律失常、对抗钙离子细胞内流等作用　】。对ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含　害的关系［Ｊ］．中华烧伤杂志，２００２，１８（５）：２７２—２７５．　量的检测发现，ＰＮＳ给药后对烧伤心肌组织的脂质过氧化反应具　［４］Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ　Ｊ，Ｈｏｒｔｏｎ　ＪＷ，Ｍａａｓｓ　ＤＬ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｊｏｒ　ｂｕｒｎ　ｔｒａｕｍａ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｃａｒｄｉａｃ　ａｎｄ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ】．Ｓｈｏｃｋ，１　９９９，１　１（１）：２９—３４．　有拮抗作用，而且与ＰＮＳ剂量呈正相关；同时可观察到心肌细胞的　［５］Ｊｅｒｅｍｙ　ＪＹ，Ｙｉｍ　ＡＰ，Ｗａｎ　Ｓ．ｅｔ　ａ１．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ，ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，ａｎｄ　ｖａｓ－　凋亡率显著下降，这也证实了脂质过氧化反应程度与心肌细胞的　ｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｃａｒｄ　Ｓｕｒｇ，２００２，１７（４）：３２４—３２７．　凋亡率呈正相关；心脏功能指标检测表明，心肌收缩和舒张功能在　［６］Ｋｗａｎ　ＣＹ，Ｋｗａｎ　ＴＫ．Ｅｆｉｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ＯＩ１　ｖａｓｃｕｌａｒ　伤后严重下降，表现为收缩压的降低和舒张压的升高，在应用ＰＮＳ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｉｎ，２０００，２１（１２）：１　１０１一　后心脏功能显著改善，心脏输出能力增强，表现为收缩压的增加和　ｌ　１Ｏ５．　舒张压的降低。在ＰＮＳ的作用过程中，是否有外周血管的作用以致　（收稿日期：２００７—０５—３０）　中国药业Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ